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1、,荧光原位杂交（FISH）技术 血液肿瘤诊疗中的应用,1,一、技术 二、质控 三、临床应用 四、多技术结合应用案例,技术理论,2,1950-1960,1960-1970,1970-1980,1980-1990,显带时期,非显带时期,1888 提出 染色 体,1914 染色体 畸变导 致肿瘤,1956 确定 染色 体46 条,1958 应用 于血 液学,1960 发现Ph 染色体 CML,显带技 术高速 发展 G/R,多种血 液病相 关异常 核型被 发现,FISH 中期/间期,多色 FISH,微阵列技术 aCGH、aSNP,CGH技术,分子遗传,细胞遗传学发展简史,3,FISH技术的发展 199
2、0年FISH 1992年CGH 1996年24色FISH （SKY、M-FISH、RX-FISH） 2001年array CGH,4,技术原理,A,G,G,C,T,A,T,T,C,C,G,A,T,A,COVALENT BOND,F,F,Specimen DNA,FISH Probe DNA,5,操作步骤,FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备） 探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针） 探针标记 杂交（76变性10min、37杂交10h） 洗脱 DAPI复染 荧光显微镜检测 结果分析,6,FISH技术的特点, 操作简便，稳定，人员培训较快 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结
3、果，24小时就可以完成检测 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞,7,FISH技术的局限性, 异常检测取决于能否获得相应探针 三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理 不能检测全基因组异常（间期FISH）,8,FISH主要仪器, FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件） 荧光原位杂交仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样器 pH仪,9,FISH技术比较,10,FISH探针种类,
4、着丝粒探针,位点探针,涂染探针,11,双色单融合探针,12,额外信号探针,13,双色双融合探针,14,正常,异 常,15,双色分离探针,16,数量、位点探针,17,人类细胞遗传学命名,18, nuc ish(CEP82)400 nuc ish(BCR,ABL)2400 nuc ish(BCR,ABL)3,(BCR con ABL2)380/400 nuc ish(MLL2)400 nuc ish(MLL2)(5MLL sep 3MLL1)100/200 nuc ish(CEPX2)2/(CEPX,CEPY)1398,19,A: nuc ish(ABL,BCR)2 B: nuc ish(ABL
5、2,BCR 3),ABL,BCR,A,ABL,BCR,B,20,A: nuc ish(ABL,BCR)3(ABL con BCR2) B: nuc ish(ABL,BCR)4 (ABL con BCR3) C: nuc ish(ABL 3,BCR 2) (ABL con BCR1),ABL,BCR,B,BCR,ABL,A,C,ABL,BCR,21,TEL,AML1,A: nuc ish(TEL2,AML13)(TEL con AML11) B: nuc ish(TEL1,AML14)(TEL con AML11) C: nuc ish(TEL2,AML15),AML1,TEL/AML1,A,A
6、ML1,TEL,B,C,22,A,B,C,D5S721,D5S721,D5S721,EGR1 EGR1,EGR1,A: nuc ish(D5S23/D5S7211,EGR11) B: nuc ish(D5S23/D5S7212,EGR11) C: nuc ish(D5S23/D5S7213,EGR11),23,质量控制,24,质量管理内容, 商品探针、自配试剂验证 标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作） 规范判读标准 建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间,25,FISH操作流程,样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等 制片：细胞悬液滴片或石蜡组织切片 预处理：2SSC，固定液，NaSC
7、N 酶消化：胃蛋白酶，蛋白酶K 变性：温度 杂交：互补结合，温度 洗涤：无附离子溶液，PH，温度 复染：DAPI II,读片：,荧光显微镜，滤镜,26,FISH技术要点, 样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂,27,规范判读,规范正常和异常信号 杂交成功率75% 计数数量、方法： 单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞 双人，每人于不同区域各计数200个细胞,28,计数规范,29,信号判读误差,30,分离信号误判,31,石蜡切片误差,32,建立阈值, 选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率 统计方法 x+3SD 分布（95%可信区间） 结合临床逐步建立生物参考区间,33,结果及报告,34,35,临床应用,36,FISH临床应用,检测染色体数目与结构异常 疗效分析 鉴定标记染色体 检测早期复发 鉴定移植后早期复发 鉴定肿瘤细胞的细胞系列 基因定位、病灶组织定位,37,FISH常用探针的组合应用,38,39,40,41,42,43,44,结语 精准方法，细致分析 新技术及多学科技术联合 探讨特征性染色体异常分子机制 疗效判断预后评估，指导靶向和个体化治疗,45,46,47,
