《酯酶与氧化酶》参考PPT

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1、1,酯酶,Esterase,2,一、基本概念 1. 定义： 酯酶(Esterase), 催化作用于酯类物质的酯健,使之水解的酶的总称,包括磷酸酶, 羧酸酯水解酶, 硫酸酯水解酶等。 羧酸酯水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是所有能催化羧酸酯水解的酶的总称（或称酯酶），其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反应式：,羧酸,3,2. 酯和酯键 酯由来自羧酸的酰基和来自醇的烃氧基组成，是羧酸与醇反应失水而生成，即羧基上羟基和醇羟基上的氢共同脱水。通式R-CO-OR，结构上可看作羧酸中的羟基被烃氧基（-OR）取代的产物，亦可看作醇中羟基的氢原子被酰基（R-CO-）取代的产

2、物。,羧酸,4,酰基（R-CO-）是含氧酸分子（RCOOH）中去掉酸性OH后（即能离解出H+的OH基）余下的基团。包括丙酰基(丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草酰基（草酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、亚硝酰基（亚硝酸）、亚硫酰基（亚硫酸）、磷酰基（磷酸）。,5,6,3. 酯酶与水解反应 羧酸酯酶水解羧酸酯为醇和羧酸 芳香酯酶水解乙酸苯酯为酚和乙酸 脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸 乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸 乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸 胆碱酯酶水解酯酰胆碱为胆碱和羧酸,7,根据酶对底物、pH、激活剂、抑制剂的反应特点，可将酯酶分为20余种，在生物化学上统称为酯酶，只有一部分可用组化的方法

3、证明。通常根据对底物是否具有特异性，可分为特异性与非特异性酯酶两种。分解短链（C2C4）低级脂肪酸酯多为非特异性酯酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶据其底物特异性可分为，分解长链(C8以上）高级脂肪酸酯的酶称酯酶(Lipase)，分解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶。,二、酯酶的分类,8,（一）非特异性酯酶(non-specific esterase)： 无底物特异性。根据E600, DFP, PCMB对它们的抑制作用不同，分为3类. 1. 芳香基酯酶(Aromesterase)，即A-酯酶，亦称有机磷酸抵抗性酯酶I。 （）底物： 萘酚乙酯 萘酚乙酸酯类 吲哚酚乙酸

4、酯类,9,（）完全抑制 10mmol/L 磷酸二乙基对硝基苯酯(E 600) 1mmol/L CuSO4 1mmol/L Pb(NO3)2 10mmol/L AgNO3 100 mol/L 对氯高汞苯甲酸(PCMB) （）激活 mmol/L半胱氨酸(Cysteine),10,、脂肪族酯酶（aliesterase),即B-酯酶，亦称有机磷酸敏感性酯酶 （）底物 萘酚乙酯； 萘酚乙酸酯类； 吲哚酚乙酸酯类。 （）完全抑制 10mol/L磷酸二乙基对硝基苯酯(E-600) 100mol/L毒扁豆碱(Eserine) 10mmol/L AgNO3,11,.乙酰酯酶(acetylesterase)：即C

5、-酯酶， 又称有机磷酸抵抗性酯酶 （）底物 吲哚酚乙酸酯类 萘酚AS乙酸酯类 （）完全抑制 10mmol/L -苯丙酸 10mmol/L AgNO3 1mmol/L CuSO4 （） 激活 100mol/L 对氯高汞苯甲酸(PCMB) 100mol/L 苯氯化汞,12,13,（二）特异性酯酶(Specific esterase) 根据底物的特异性分为三种: 、脂酶(Lipase) 底物：高级脂肪酸 抑制剂：毒扁豆碱(eserine) 激活剂：2.5%牛磺胆酸钠 、胆碱酯酶(cholinesterase) 特异性底物：丁酰硫代胆碱 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA) 3、乙酰胆碱酯酶

6、(Acetylcholinesterase) 底物：乙酰甲基硫代胆碱 乙酰硫代胆碱 乙酰基吲哚重氮盐 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA),14,酯酶的鉴别 、根据底物特异性 选择特异底物配制孵育液 、选择一定浓度的抑制剂或激活剂 通常使用抑制剂的方法是向底物液中加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。,15,（一）显示法 A.偶氮色素法 、反应原理 在酶作用下，从底物游离出来的-萘酚AS与重氮盐偶联形成偶氮色素，同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。 -萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝RR，坚牢红RC盐。 萘酚AS系统用柘榴石（黄色）、GB盐、坚牢红RC、坚牢红紫

7、LC盐。,三、非特异性酯酶,16,17,18,2. 孵育液 （萘酚AS乙酸酯法 Pearse,1972） 1%萘酚AS醋酸盐（丙酮溶液）0.1ml (底物） 0.05mol/L PBS(pH 7.0) 10ml（缓冲液） 坚牢蓝B盐30mg（重氮盐） 搅拌过滤使用 3. 操作步骤 (1)新鲜组织恒冷箱切片； (2)入孵液，室温或37 20-30min； (3)流水冲洗2min； (4)2%甲基绿复染细胞核； (5)流水冲洗3-5min； (6)甘油明胶封固。,19,4. 结果与评价 酶活性部位为黑色，胞核为绿色。活性部位的染色视重氮盐不同而异。坚牢红TR为紫红色，坚牢红RC为暗红色，坚牢蓝RR

8、为青铜色。,5. 组织处理说明 非特异性酯酶类对固定的抵抗性较强，可用醛类固定液固定后冰冻切片。10%福尔马林钙、4%多聚甲醛磷酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液，pH7.2-7.4; 4固定16-18小时，时间随酶活性强弱不同。,20,-醋酸萘酚酯 萘酚AS乙酸酯 坚牢蓝B盐 坚牢蓝BB盐,21,B.偶氮吲哚酚法 1. 反应原理 在非特异性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯被水解为吲哚酚和醋酸，吲哚酚与六氮盐偶联成偶氮色素。,吲哚酚酯,吲哚酚,羧酸,+,六氮盐 偶氮色素,22,2. 孵育液 醋酸吲哚酚 3mg 二甲基甲酰胺 0.3ml 六氮化副蔷薇苯胺缓冲液10ml （六氮化副蔷薇苯胺0.3ml溶于0.1mo

9、l/L PBS pH5-6,用1mol/L-0.1mol/L NaOH将pH调至5-5.5，混匀过滤立即使用。）,23,3. 操作步骤 (1)恒冷箱切片入孵液，3715-60min； (2)蒸馏水洗； (3)4%甲醛固定数小时； (4)甘油明胶封固。,4. 结果 酶活性处呈红棕色,腹水癌细胞中的酯酶,24,巨噬细胞中的酯酶,25,C.吲哚酚法(靛蓝法) Pearse, 1972 .原理 醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化形成靛蓝沉着于酶所在部位。,底物:5-溴-6-氯吲哚酚乙酸酯,5-溴吲哚酚乙酸酯等. 氧化剂:铁氰化钾、亚铁氰化钾,26,.孵育液 (1)醋酸溴吲哚酚酯2mg (2)二甲基

10、甲酰胺0.2ml (3)储备液10ml,储备液配制： 铁氰化钾(1.65%)5ml 亚铁氰化钾(2.11%)5ml 0.1mol/L Tris-HCL缓冲液pH6.820ml 2%CaCL210ml 蒸馏水10ml,27,3. 操作步骤 新鲜组织恒冷箱切片； 切片入孵育液，37或室温 5-120min； 蒸馏水洗； 甘油明胶封固。 4. 结果 酶活性部位呈青绿色，背底无色。 .注意 铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。 因此酶活性与显色无平行关系，可定性不可定量。,28,肾间质细胞 油螺卵母细胞 底物：5-溴吲哚酚乙酸酯,29,主要定位于内质网和溶酶体，生理功能尚不清楚,目前认为主要

11、参与酯类和蛋白质代谢。 极强阳性：胰腺外分泌部腺细胞，横纹肌运动终板，小肠 上皮细胞； 强阳性：肝细胞，肾近曲小管上皮，结肠上皮细胞； 阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡 巨噬细胞，睾丸间质细胞。 弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支 气管、膀胱等上皮细胞。,（二）非特异性酯酶的生物学意义,30,31,广义的胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶（AChE)和狭义的胆碱酯酶(ChE)，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能水解乙酰-基甲基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱抑制。但胆碱酯酶却不同，乙酰胆碱浓度越高，越

12、能被胆碱酯酶所分解。ChE还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰-基甲基胆碱。,乙酰胆碱+H2O 胆碱+醋酸 酯酰胆碱+H2O 胆碱+羧酸,AChE,ChE,四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(Acetylcholinesterase and Cholinestrase, AChE and ChE),32,AChE 和 ChE的底物特异性,33,（一）显示方法亚铁氰化铜法,1、反应原理 利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫代胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，再与铜离子结合形成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存在。,乙酰胆碱盐,AChE,硫代胆碱,若用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显示乙酰胆碱酯酶

13、。,铁氰化钾,亚铁氰化钾+Cu2+,亚铁氰化铜,34,、孵育液 乙酰硫代胆碱碘盐5mg 0.1mol/L醋酸缓冲液pH5.56.5ml 0.1mol/L (2.94%) 柠檬酸钠0.5ml 30mmol/L (0.75%) CuSO41.0ml 5mmol/L (0.164%) 铁氰化钾1.0ml 蒸馏水1.0ml 乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加入其它溶液，临用前不超过30分钟内配制，充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终pH5.5。,35,、操作步骤 (1) 新鲜组织恒冷箱切片； (2)冷丙酮或10%福尔马林固定20-25min； (3)蒸馏水洗； (4)入孵育液37，h； (5)蒸馏水

14、洗； (6)甘油明胶封固。,36,、结果与评价 乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。 Cu2+浓度太小易弥散，pH5-5.5，高于易扩散。 、对照 用四异丙基焦磷酰胺4mM(0.137%) 0.2ml抑制胆碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶； 用毒扁豆碱硫酸酯310-5M代替蒸馏水，先将切片处理30分，水洗后入孵育液，则二种酶均被抑制呈阴性。,37,(二）生物学意义 胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标，亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化的一个指标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为胆碱能传递部位的标志。 AChE是生物神经传导中的一种关键

15、性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。,38,AChE与细胞凋亡有一定的关系。在细胞水平发现实验所用的各类细胞，正常状态没有AChE活性反应，一旦发生凋亡，都有AChE活性反应。用其特异的抑制剂可以抑制其活性反应。用RT-PCR方法证明了凋亡细胞有AChEmRNA的转录。加入其抑制剂石杉碱可降低凋亡基因的表达。 乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统（大脑皮质中有AChE阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元中）、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主要分布于血清、胰腺、唾液腺内。,39,五、胆碱乙酰转移酶 (choline ace

16、tyltransferase, ChAc),此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChAC确认为胆碱能神经的标志酶。,40,（一）显示方法Burt法,1、反应原理,胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶A的乙酰基转移到胆碱分子上,合成乙酰胆碱。辅酶A被游离出来，辅酶A中的SH被铅离子沉淀而显示酶的活性。 乙酰辅酶A+胆碱 乙酰胆碱+辅酶A Pb2+ 沉淀产物 PbS 硫化铵,41,2、孵育液,25mmol/L N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲 液（HEPES） pH6.0 4mmol/L 胆碱（48.5mg/100ml缓冲液） 0.2mmol/L 乙酰胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液） 18mmol/L 硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液） 0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰胆碱酯酶抑 制剂）（3.8mg/100