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1、实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳,主讲：姜婧怡 生物化学教研室,实验目的：,掌握电泳的基本原理，加深对蛋白质两性解离性质的理解。 掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本操作。,实 验 原 理,电泳技术（Electrophoresis）,电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳.,背景：电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,为了克服溶
2、液对电泳离子的影响，一般在电泳体系中加入不流动的固体支持物。 （一）按支持物的物理性状不同，可分为： 1滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、聚氯乙烯纤维薄膜、醋酸纤维)电泳 2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳； 3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。,电泳的分类,（二）按支持物的装置形式不同，可分为：,1平板式电泳：支持物水平放置；,2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳,(三)按pH 的连续性不同，区带电泳可分为： 1连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 2非连续p
3、H 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。,电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即,V粒子运动的速度 X电场强度 Q粒子所带电荷 r粒子的半径 介质的粘度,影响电泳速度的主要因素,1.样品本身: 分子带电量：Q越多，u越大； 分子大小: 分子小，r越小，u越大； 分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦 越小，u越大。 形状越规则，u越大， 反之则越 小。 球形分子 纤维状分子,2.缓冲溶液：,A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大,B.离子强度(I)： 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就
4、是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。,一般离子强度的选择范围在0.020.2之间。,3.电场强度(X):,电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。,X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。,注意：电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。,电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒
5、的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。,4电渗现象,醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经 乙酰化而成。涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。 醋酸纤维素薄膜电泳有以下优点： 微量、快速、简便、分辨力高、 对样品无拖尾和吸附现象,实验原理,以蛋白质为例：,pHpI pH=pI pHpI,H,H,OH,OH,蛋白质兼性离子,蛋白质阳离子,蛋白质阴离子,（等电点）,实验原理,以蛋白质为例：,实验原理,人血清中几种主要蛋白组分,缓冲液pH=8.6,pHpI,血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。,经醋酸纤维素薄膜
6、电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带,染色和定量,膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。,各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。,可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。,用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。,实验步骤：,1准备与点样：,取一条2.58cm的膜条,充分浸透在巴比妥缓冲液中,取出膜条,滤纸吸去多余的缓冲液,无光面距一端1.5cm处作点样线,点样器下端粘上薄层血清,垂直 点样,（注意：在薄膜负极端写好学号或者做好标记),2电泳,放置 膜条,点样端置于阴极,点样面向下,膜条贴 紧滤纸，拉直膜条,平衡10 分钟,通 电,电压：160v,时间：50 min,关闭 电源,3染色、脱色,通
7、电 完毕,取出 膜条,浸于染色液（氨基黑10B）中,3min,取出 膜条,依次浸于漂洗液、,各5min,直至 漂净,滤纸吸 干薄膜,.定量 (两人的膜条共用),取试管6支，编号16,充分振荡、脱净染料,比 色、定 量,15min,实验结果：,原始数据：,各样品吸光度值,仪器型号： 吸收波长：,650nm,光密度总和T2A12,1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。 清蛋白（2A / T）100 1球蛋白（ 1 / T）100 2球蛋白（ 2 / T）100 球蛋白（/ T）100 球蛋白（/ T）100,2计算出清蛋白与球蛋白之比值（2A/G） G=12,血清蛋白电泳结果的临床意义：,临床上
8、还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系： 正常人A/G1.52.5,注意事项：,1、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。,4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 5、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。,下次实验： 血清-球蛋白的提纯,预习要点： 1.盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白 质的基本原理及操作 2.蛋白质定性检测的方法。 3.离心机的原理及操作。,
