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1、1,第九章,丝裂原活化蛋白激酶 信号转导通路,2,丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) Ser/Thr蛋白激酶 受细胞外刺激而激活 在所有真核细胞中高度保守 通路组成 三级激酶模式 调节多种重要的细胞生理/病理过程,3,本章主要内容： MAPK 信号通路的成员 MAPK的蛋白结构 MAPK通路模式 MAPK的激活 MAPK信号转导通路间的关系,4,一、MAPK 信号通路的成员 MAPK是信号从细胞表面核内的重要转递者。 已鉴定的 (据1999的统计)： MAPK激酶激酶 (MKKK) 14种 MAPK激酶 (MKK) 7种 MAPK
2、 12种,5,MKKK(MAP Kinase Kinase Kinase) 亚族：,6,7,MKK (MAP Kinase Kinase)亚族：,8,MAPK (MAP Kinase)亚族：,9,10,二、MAPK的蛋白结构 （一）MAPK的一级结构 苏氨酸磷酸化位点与其他蛋白激酶同源，酪氨酸磷酸化位点是MAPK独特的。 磷酸化位点的三肽模体 TXY ERK和ERK5 TEY p38 TGY JNK TPY,11,12, 三肽模体位于L12 各亚族L12长度不同 活化唇 (activation lip) 各亚族都具有12个保守亚区 真核细胞蛋白激酶超家族区分标志之一 家族成员之间具有较高的同源
3、性,13,哺乳动物MAPK,14,哺乳动物MAPK,15,16,（二）MAPK的二级结构和超二级结构 以ERK2为例 N端域 主要由折叠和2个螺旋组成 （1109和320358位氨基酸残基） C端域 螺旋，含磷酸化唇和MAPK插 入，催化环（Arg-147152) （110319位氨基酸残基） 交界处的裂隙 ATP结合位点,17,18,19,20,（三）MAPK的空间结构特征 大体结构：非常相似 底物结合口袋的结构特征： 无活性时被阻断，有活性时暴露出。 ATP结合位点的结构特征： 大小、形状、疏水性和电荷等不同 磷酸基团结合位点： 4个保守位点,21,22,三、MAPK通路模式,23,四、M
4、APK的激活 MAPK激活机制的发现 重要的实验观察： 20世纪80年代，观察到当GF刺激时，Tyr被磷酸化的主要蛋白为42kDa 佛波酯醇刺激时，产生同样的蛋白 胰岛素RTK催化Ser/Thr蛋白激酶 胰岛素刺激，产生Thr和Tyr双磷酸化的42kDa蛋白,24,MAPK的激活机制 活性部位位于两个折叠域的界面 是通过Thr和Tyr的双位点同时磷酸化而被激活 例：ERK2 Tyr-185 , Thr-183 pY185 解除L12对底物结合的阻断 MAPK是Pro指导的蛋白激酶,25,26,对于ERK2来说，其底物的一般保守性序列为 Pro-X-Ser/Thr-Pro 活化环中Tyr-185
5、 和Thr-183的磷酸化， 引起该环重新折叠，与Arg结合位点相互作用 酸性氨基酸替代，不导致组成性活化 MAPK的点突变不影响其活性,27,五、酵母MAPK通路 酿酒酵母 已鉴定出5条 单倍体的交配途径 浸润性生长通路 细胞壁重构通路 双组分渗透压感受器通路 Sho1渗透压感受器通路,28,（一）酵母菌中MAPK模式的组成和作用 酿酒酵母：4种MKKK 4种MKK 6种MAPK 其中，4种参加明确的5种MAPK通路 2种 (SMK1, YKL161C)参加未知的MAPK通路 3个成员通过与支架蛋白结合而联在一起,29,（二）单倍体酵母与交配有关的通路 酿酒酵母的2种交配型(单倍体)： a细
6、胞型和 细胞型 2种性信息素：a因子和 因子 7次跨膜受体：Ste3和 Ste2 异三聚体G蛋白： Gpa1 亚基 Ste4 亚基 Ste18 亚基,30,31,32,Ste2 receptor,酿酒酵母的交配通路,ste： 不育基因 Ste5： 支架蛋白 Ste12： 转录因子,33,支架蛋白 ( Scaffold protein) 其主要功能是将其他蛋白质结合在一起，促进它们相互作用。 将细胞信号通路中的各种信号分子结合在一起，形成复合物 起生理性隔室化的效应,从而防止该通路与其他通路发生交联 含有许多蛋白结合域,34,（三）浸润通路 缺乏氮源 形态改变 假菌丝： 缺乏氮源时，椭圆型的双倍
7、酵母进行不对称的细胞分裂以产生一个细而长的子细胞，后者又不断产生长的子细胞。由于母细胞与子细胞仍然相连，因此这种单级分裂方式的不断重复将产生由延长的细胞组成的丝状物。,35,KSS1： 丝状生长所需要 (单倍体，双倍体) 注： 未被Ste7激活时，是浸润生长的抑制物，被Ste7激活时，刺激浸润生长。,36,FUS3和KSS1的鉴别： 刺激激活的条件不同 FUS3 信息素 KSS1 缺乏氮源 表达不同 FUS3 单倍体细胞中 KSS1 单倍体细胞和双倍体细胞中 对浸润生长的调节作用 FUS3 抑制 KSS1 刺激,37,（四）细胞壁重构通路, 酵母的生长依赖于有效的细胞壁重构 PKC1：MKKK
8、K MKK1和MKK2的重叠作用意义不清,38,（五）渗透压感受器和应激通路 酿酒酵母的2种渗透压感受器： “双组分”渗透压感受器 低渗透压条件下激活 膜渗透压感受器 高渗透压条件下激活 2种渗透压感受器对MAPK通路的调节 作用不同,39,1. “双组分”渗透压感受器 “双组分”转导体系通常见于原核细胞 “双组分”转导体系的组成 感受器分子 胞外区 + 胞质His激酶域 + 反应-调节分子 接受域 + DNA结合域 是一种His-Asp磷酸化体系 “双组分”转导体系在哺乳类尚未鉴定出,40, “双组分”转导过程 感受器蛋白活化 胞质激酶域的His磷酸化 反应-调节分子接受域 的Asp磷酸化
9、启动输出功能，即转录激活作用,41,酵母 “双组分”渗透压感受器： 由3种蛋白组成 Sln1 + Ypd1 +Ssk1 两个相连的“双组分”体系 第一个 Sln1(His激酶域和接受域) 第二个 Ypd1 (His激酶域) + Ssk1 (接受域),42,在低渗透压条件下 Sln1 是有活性的 Ssk1是无活性的 HOG1也无活性 在高渗透压条件下 Sln1 是无活性的 Ssk1是有活性的 HOG1也有活性,43,2. Sho1依赖的渗透压感受器 Sho1：跨膜蛋白渗透压感受器 结构 ：4个跨膜区 + C-末端胞质区 ( 含SH3域),44,在高渗透压条件下 Sho1 感受高渗透 Sho1激活
10、Ste11 Pbs2发挥支架蛋白的作用 Pbs2含有多聚脯氨酸富集区,45,46,47,3. 裂殖酵母菌中的渗透压感受通路和 应激通路 环境应激时激活2个相关的MAPK通路 WIK/WIS/SPC1通路 WIN1/WIS/SPC1通路 (在渗透压应激时起主要作用) 上游调节因子Mcs4是Ssk1蛋白的同源物 ATF1是SPC1的主要核内底物,48, SPC1只有经磷酸化后才能入核 热休克和氧应激时SPC1磷酸化激活，但不需要WIS的作用。 Pyp1使SPC1脱磷酸化,49,（六）芽孢形成通路 芽孢形成：是指将单倍体核包装入芽孢的过程 包括减数分裂。 仅发生在双倍体 由饥饿诱发 芽孢形成过程：
11、减数分裂 双层膜的原孢子壁包裹单层核膜的4个单倍体 从原孢子壁的双层间隙沉积孢子壁。,50,孢子壁的组成：共4层： 第一、二层：同植物细胞壁 第三层：孢子特异性的结构 聚乙酰氨基葡糖 + 聚氨基葡萄糖 第四层：电子密集层 双酪氨酸包被,51,从以上酵母MAPK通路的研究中看到: MAPK通路是一个连续的蛋白激酶激活的途径 MAPK的主要底物为转录因子 MAPK通路受不同的上游因子调节 信号转导是高度特异的 某一种蛋白成员存在于数种通路时,支架蛋白起着隔室化的作用,52,53,54,六、哺乳动物MAPK通路 哺乳动物MAPK通路不同于酵母: 多种MAPK通路可被一种受体型所激活 MAPK的主要底
12、物包括转录因子、 胞 质蛋白质 、细胞骨架、蛋白激酶和磷脂酶 已鉴定出4条MAPK通路 MAPK有多种亚族和多种不同的剪接体,55,（一）ERK通路 研究得最为透彻 ERK的MAPK有5种 (15) 它们分属于不同的亚族 ERK1和ERK2(ERK1/2)研究得最为透彻 为细胞内主要的MAPK ERK3存在于细胞核 ERK4通过Ras依赖性通路而被激活,56,1. ERK1/2通路中MKKK 许多受体通过活化Ras激活ERK1/2通路 Raf: 是该通路中的重要的MKKK 亚型: 有3种 A-Raf 、 B-Raf 、 Raf1 组成: 含3个结构域 C-末端的激酶域 富含Cys的调节域 含R
13、as结合位点的调节域,57, 表达: Raf1在体内广泛表达 而A-Raf 和B-Raf表达方式严格 如B-Raf 主要在神经组织中表达 激活: 酶水平的调节较复杂 主要包括2个过程: 一是结合于GTP- Ras 二是 磷酸化 ( 一簇 Ser338, Ser339, Tyr340, Tyr341),58,Raf1对于H-、K-和N- Ras显示应答 B-Raf 可被Rap1a活化 TC21能够与Raf1和B-Raf相互作用，激活它们。 上游激酶的调节: 已知磷酸化Raf1的激酶有Src 、PAK、PKC及其他蛋白激酶,59, 其他的磷酸化位点 Ser259和Ser621 调节Raf1与14-
14、3-3蛋白结合，稳定其活性。不过， 14-3-3蛋白也可能抑制Raf活性。抑制性的磷酸化位点是由Akt (Ser259)和PKA催化的。 抑制：RKIP可干扰Raf-MEK的结合，抑制后者磷酸化和活化。,60,2. ERK1/2通路中MKK (MEK) MEK1和MEK2是该通路主要的MEK 为双特异性蛋白激酶 通过两个残基的磷酸化而被激活 ( Ser或Thr) (同MAPK) 突变可引起其活性增加(不同于MAPK) 酸性氨基酸替代，明显增加其活性 特异性较高，仅磷酸化少数底物,61, MEK4可磷酸化非MAPK MEK1和MEK2含3个非酶活性结构域 ERK1/2结合位点 ( D域 ) 富含
15、Pro结构域 核输出序列 ( NES ),62, MEK1和MEK2的上游调节因子 Raf、RTK、非RTK、GPCR 在转化细胞： Ras Raf1 MEK1 ERK1/2 在心肌细胞 A-Raf MEK1 ERK1/2 在PC细胞 B-Raf MEK1 ERK1/2,63,64,3. ERK1/2蛋白激酶的作用底物及灭活 底物的保守性磷酸化位点模体为 Pro-Lue-Ser/Thr-Pro 底物蛋白 胞质蛋白: p90S6K 、cPLA2 、EGF 受体 细胞骨架: MAP1、2 、4 、Tau 转录因子：Elk-1, Ets-1, Sap1a, c-Myc等 灭活: MKP-1, -3, -4,65,4. ERK1/2通路的生物学功能 刺激细胞增殖 抑制细胞生长、分化 细胞周期调控 调控MTOC 纺锤体的组装 促进细胞存活 某些情况下，与细胞死亡有关,66,67,68,69,（二）JNK信号转导通路
