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1、.,1,RT-PCR常见问题分析,.,2,一 、 RT-PCR反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。,.,3,1 RT-PCR反应步骤： 第一，RNA提纯； 第二，RT逆转录； 第三，PCR聚合酶反应,.,4,.,5,2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成， 有助于减少污
2、染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。,.,6,2.3 一步法与两步法区别： 一步法RTPCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中，两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息，并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA，从而更易于保存。另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。,.,7,3 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性： 3.1 首先应确定模板RN
3、A完整性好，无DNA污染。 3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好，可提高逆转录反应温度。 3.6 设计引物时，避免在引物3端含有互补序列，避免可以形成内部发卡结构的序列。,.,8,RT-PCR常见问题,.,9,问题一：RT-PCR仅有少量或没有产物,1.RNA被降解,分离无污染或高质量的RNA；提取RNA材料要尽量新鲜，防止RNA降解。 RNA提取后，应储存在100甲酰胺
4、中，如果使用RNase抑制剂，加热时45；pH8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且，在0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。,物,对策,.,10,2. RNA中包含 逆转录抑制剂,过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25g到0.4g/l)以帮助小量样品RNA的恢复;逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐;将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂;,对策,.,11,3.用于合成 cDNA第一链 合成的引物 的退火不充分,1.确定退火温度适合实验中所用的引
5、物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟。 2.对于基因特异性引物（GSP），可以试以下其他GSP，或换用oligo(dT)或随即六聚体确定GSP是反义序列。,对策,.,12,4.起始RNA量 不够 5. 多糖同RNA 共沉淀,增加RNA量;对于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1g到0.5g乙酰BSA; 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖;,对策,对策,.,13,6.RNA模板 二级结构太多,将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火;提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对 ThermoScript可以到65。注意：不要在60时
6、使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP;对于1kb的RT- PCR产物，保持反应温度65。不要在高于37时使用M-MLV;如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物;,对策,.,14,7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感 8.靶序列在分 析的组织中不 表达 9.PCR没有起 作用,在PCR前用RNaseH处理。 尝试其他靶序列或组织 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物;,对策,对策,对策,.,15,10.PCR引物设 计较差,避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0
7、.1M到0.5M之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。,对策,.,16,11.富含GC的 模板,于GC含量50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。,对策,.,17,12. 镁离子浓度 太低,从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。,对策,.,18,13.退火温度 太高,使用公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。,对策,.,19,问题二：产生非特异性
8、条带,.,20,1.引物和模版 的非特异性 退火,1.避免引物3端含有2个到3个dG或dC 2.在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随即引物或oligo(dT)。 3.在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 4.使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。,对策,.,21,2.基因特异性引 物设计较差 3.RNA中有基 因组DNA的污染,遵循用于扩增引物设计的同样原则 1.使用扩增级DNase 1处理RNA。 2.设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染,对策,对策,.,22,4.形成引物二 聚体 5.镁离子浓度 太高 6.沾染外源 DNA,设计在3端没有互补
9、序列的引物。 对于每一个模板和引物组化优化镁离子浓度。 使用抗气雾剂和UDG酶。,对策,对策,对策,.,23,问题三：产生弥散条带,.,24,原因,对策,.,25,问题四：灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物?,.,26,1、 初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度。 2、 RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。 3、 RNAse污染：维持无菌条件;加入RNase抑制剂。 4、 无效的cDNA：通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂。 5、 无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整cDNA合成温度或引物设计。,
10、.,27,问题五：信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物?,1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。,.,28,问题六：电泳后出现意外的条带 RNA?,原因,对策,.,29,问题七:产生大分子量的弥散条带,大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的。对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）,.,30,问题八： 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果,通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。 有可能是引物二聚体的条带,.,31,问题九： 扩增产物滞留在加样孔中,有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性,.,32,Thank You!,.,33,
