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1、,基因表达系统,第五章 外源基因的表达,一、大肠杆菌基因工程 二、酵母杆菌基因工程 三、哺乳动物基因工程 四、高等植物基因工程 五、外源基因表达产物的分离纯化,一、大肠杆菌基因工程,E.coli作为表达外源基因受体菌的特征 外源基因在E.coli中高效表达的原理 E.coli基因工程菌的构建策略 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 利用重组E.coli生产人胰岛素,（一）E.coli作为表达外源基因受体菌的特征,E.coli表达外源基因的优势：,全基因组已测序，共有4,405个开放阅读框架，大部分基因生物学功能已鉴定；,基因克隆表达系统成熟完善；,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；,被美国
2、FDA批准为安全的基因工程受体生物。,E.coli表达外源基因的劣势：,缺乏对真核生物蛋白质的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化；,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能，表达产物多以无活性的包涵体形式存在；,内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；,细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量内毒素即可导致人体热原反应。,（二）外源基因在E.coli中高效表达的原理,强化蛋白质生物合成 抑制蛋白质产物降解 恢复蛋白质特异性空间构象,启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,强化蛋白质生物合成,1、启动子(promoter, P),启动子：位于结构基因上游，能被RNA聚合酶
3、识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列，长40-60bp 。,因此，E.coli表达载体所用的启动子必须是E.coli启动子。,没有启动子，基因就不能转录。 E.coli的RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。,位于转录起始点上游35bp处，由10bp组成，5-TGACA。,E.coli启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：,位于转录起始点上游5-10bp处，由6-8bp组成，5-TATAAT，富含A和T，又称TATA盒。,-10区：,-35区：,-35区与RNA聚合酶s亚基结合 -10区与RNA聚合酶的核心酶结合,-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列。,启动子和外源基因转
4、录起始点之间的距离。,启动子是控制外源基因转录的重要元件，mRNA生成速率与其强弱密切相关。,-10和-35区与保守序列（5-TATAAT、5-T GACA）相似度越高，启动子活性越强。,-10和-35区的间距越接近17bp，启动子活性越强。,-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列：,大多数E.coli启动子与所属基因转录起始点之间的距离是6-9bp，但对外源基因而言，这个距离范围未必最佳。,启动子和外源基因转录起始点之间的距离：,1）启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,E,E,启动子,A酶切开,Bal31酶解,目的基因,将目的基因插在一个强启动子下游，若克隆菌内检测不到mRNA，有
5、必要考虑调整启动子与基因之间的距离。,2）启动子的筛选：,探针质粒pKO1的报告基因： 半乳糖激酶基因galK,终止子,Ampr,ori,无启动子 的galK,pKO1 3.9 kb,3）启动子的构建：,-35 区序列,-10 区序列,启动子 来 源,Plac Ptrp PL PrecA Ptac,T T T A C A T T G A C A T T G A C A T T G A T A T T G A C A,T A T A A T T T A A C T G A T A C T T A T A A T T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 双Plac串
6、联 = 2.4 Plac,乳糖操作子 色氨酸操作子 噬菌体早期操作子 recA基因 Ptrp-35区 + Plac-10区,4）启动子的可控性：,外源基因的全程高效表达，会对E.coli的生理生化过程造成不利影响。,外源基因持续高效表达的重组质粒，在细胞若干次分裂后，会部分甚至全部丢失，导致重组菌不稳定。,措施：,利用可控性启动子，调整外源基因的表达时序，通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长的某一特定阶段。,目前广泛应用的E.coli可控性启动子来自相应的操纵子，都含有与阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列，其介导的外源基因在E.coli中通常以极低的基底水平表达。,乳糖
7、启动子Plac的可控性：,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,噬菌体启动子PL的可控性：,在大型发酵罐中迅速升温困难，常使用双质粒控制系统，间接控制目的基因表达。,应是诱导型的，可通过简单方式、使用廉价诱导物诱导，如温度诱导、IPTG诱导。,最佳启动子必须具备条件：,必须是强启动子，能使外源基因表达量达细胞总蛋白的10-30%以上；,应呈现低水平的基础转录；,2、终止子(terminator, T),强化转录终止的必要性：,过长转录物的产生会影响外源基因的表达。,外源基因在强启动子控制下表达，易发生转录过头现象，RNA聚合酶滑过终止子，继续转录邻近序列，形成长短不一的mRNA混合物。,过长转录产物
8、影响外源基因表达的原因：,1）转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因转录效率下降。,2）若外源基因下游紧接载体的重要功能基因，则RNA聚合酶在此处的转录，可能干扰其生物功能，甚至导致其不稳定性。,4）过长的mRNA往往不能形成理想的二级结构，大大降低翻译效率。,3）过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗。,pCP1,Ampr,ori,Tcr,筛选Ampr、Tcs的转化子,也可通过探针质粒筛选， 唯一的克隆位点处于启动子和报告基因的翻译起始密码子之间，当终止子插入该位点时，由启动子介导的报告基因转录被封闭，从而减少或阻断报告基因的表达
9、。,P,T,强终止子的选择与使用：,对终止作用较弱的终止子，可采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强转录终止作用。,常用终止子来自E.coli rRNA操纵子上的rrn T1T2、T7噬菌体DNA上的T。,E.coli偏爱使用终止密码子UAA，当其后连上一个U而形成四联核苷酸时，转译终止效率会得到进一步加强。,3、核糖体结合位点,外源基因在E.coli中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，还与mRNA的翻译起始效率密切相关。,结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，差别高达数百倍。,mRNA的翻译起始效率主要由其5端的结构序列决定，即核糖体结合位点(ribosomal binding sit
10、e, RBS)。,1）SD序列：,E.coli RBS的结构：,识别核糖体小亚基中16S rRNA 3端区域3-AUUCCUCC-5，并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，启动翻译。,位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5-UAAGGAGG-3。,2）翻译起始密码子：,E.coli绝大部分基因以AUG作为翻译起始密码子，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。,RBS对外源基因表达的影响：,1、SD序列的影响：,mRNA与核糖体结合越强，翻译起始效率越高，结合程度取决于SD序列(5-UAAGGAGG-3)与16S rRNA的碱基互补性。 以GGAG尤为重要，4个碱基中任
11、何1个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度下降。,2、翻译起始密码子的影响：,E.coli起始tRNA可同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但识别频率不同：GUG为AUG的50%、UUG为AUG的25%。,3、SD序列与起始密码子之间距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证mRNA在核糖体上定位后，AUG正好处于P位，这是翻译启动的前提。,通常SD序列位于AUG前约7bp处，在此间隔中少1个或多1个碱基，均导致翻译起始效率不同程度的降低。,4、SD序列与起始密码子之间序列的影响：,SD序列下游碱基为AAAA或UUUU时，翻译效率最高；为CCCC或GGGG时，翻译效率是最高值
12、的50%和25%。,如：-半乳糖苷酶mRNA，在此位置上的最佳碱基是UAU或CUU，如用UUC、UCA或AGG取代之，酶的表达水平下降20倍。,紧邻AUG的前3个碱基也会影响翻译起始效率。,5、起始密码子后续若干密码子的影响：,从AUG开始的前几个密码子的碱基序列也至关重要，这一序列不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,目前广泛使用的E.coli表达型质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的。,4、密码子,生物体对密码子的偏爱性：,不同生物、甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率不同，具有一定的偏爱性。,生物体对
13、密码子偏爱性的决定因素：,生物基因组中的碱基含量；,密码子与反密码子相互作用的自由能；,细胞内tRNA的含量。,1、生物基因组中的碱基含量：,在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第3位上U和A出现频率较高。,在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第3位上含G或C的简并密码子占90%以上。,2、密码子与反密码子相互作用的自由能：,适中的作用强度有利于蛋白质生物合成的迅速进行。,弱配对作用可能使氨酰基tRNA进入核糖体A位需要花费更多的时间。,强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。,如：,GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、A
14、UA、UAU等使用少。,GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,3、细胞内tRNA的含量,简并密码子使用频率与相应tRNA的丰度呈正相关。,表达量高的基因含有较少种类的密码子，这些密码子又对应于高丰度的tRNA分子，以便细胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白质。,密码子偏爱性对外源基因表达的影响：,原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，因此哺乳动物基因在E.coli中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。,使外源基因上的密码子在E.coli中获得最佳表达的策略：,1、外源基因全合成,按E.coli密码子的偏爱性规律，更换外源基因中不适宜的简并
15、密码子。,如：重组人胰岛素、干扰素、生长激素在E.coli中的高效表达均采用了这种方法。,可将这两个tRNA编码基因克隆在另一高效表达质粒上，构建双质粒表达系统。,2、同步表达相关tRNA编码基因,如：人尿激酶原基因的412个密码子中，有22个Arg密码子，其中7个AGG、2个AGA，而E.coli中tRNAAGG和tRNAAGA丰度较低。,5、质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响：,表达型质粒在每个E.coli细胞中达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程常发生在受体细胞对数生长期，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。,质粒的过度增殖、目的基因的高效表达会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性、目的基因表达水平下降。,措施： 将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。,质粒扩增时序的控制：,pCP3拥有温度可诱导的复制子。,28时，每个细胞的质粒拷贝数为60；,42时，拷贝数迅速增至300-600，受体细胞表达的温度敏感型阻遏蛋白CI857失活，外源基因表达。,用温度可同时控制质粒拷贝数和外源基因表达。,（三）大肠杆菌基因工程菌的构建策略,包涵体型表达 分泌型表达 融合型表达 寡聚型表达 整合型表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,1、包涵体型表达,E
