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1、-克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的检测 -农业部畜禽产品质量安全监督检验测试中心（石家庄） 李志平,饲料中添加-兴奋剂的原因,-兴奋剂的危害,中国政府监控情况,-兴奋剂的使用现状,-兴奋剂检测方法,检测方法对比,确认方法,筛选方法,检测方法标准,农业部1025号公告-11-2008猪尿中-受体激动剂多残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-3-2008动物尿液中11种-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1025号公告-16-2008动物尿液中盐酸克仑特罗残留检测 气相色谱-质谱法 NY /T 933-2005尿液中盐酸克仑特罗的测定 农牧发200138号文件猪尿中盐酸
2、克仑特罗检测方法-酶联免疫吸附测定法,农业部1025号公告-6-2008动物性食品中莱克多巴胺残留检测 酶联免疫吸附法 NY/T1460-2007饲料中盐酸克仑特罗的测定 酶联免疫吸附法 农业部1025号公告-18-2008动物源食品中-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-6-2008饲料中13种-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法,克伦特罗金标检测试剂条的原理和使用,一、盐酸克伦特罗简介 二、金标免疫试剂条原理 三、金标快速检测试剂条检测操作步骤 四、注意事项 五、样品的提取方法 六、其它类金标速测试剂条简述,一、盐酸克伦特罗简介,何为“瘦肉精”？,盐酸克伦特
3、罗（Clenbuterol Hydrochloride ，CL） 4-氨基-（叔丁胺甲基）-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐,1、药理作用,克伦特罗又名双氯醇胺，氨哮素，克喘素，是一种人工合成的2-肾上腺素受体激动剂（2-激动剂）。白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。 具有强效松弛支气管平滑肌，扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。 当其应用剂量达到治疗量的510倍时，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精”。,2-肾上腺素受体激动剂,2-肾上腺素受体激动剂（2-激动剂）包括：克伦特罗、莱克多巴胺、沙
4、丁胺醇、特布他林、西马特罗、菲诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、奇帕特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗等十几种。我们目前监测的主要是克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇（有快速检测方法的）。,注：+表示增加，表示减少。,-激动剂对畜禽生长作用的影响,2、克伦特罗（瘦肉精）的同化作用,瘦肉精等非法使用途径,1、养殖环节：拌入饲料中和饮水中添加，用以增重、增加瘦肉率、改善毛色和体型； 2、收购、贩卖中注射或饮水中添加，导致生猪大量饮水，以保持体重、改善毛色等； 3、部分违法分子收羊后，秘密集中饲养20-30天，大剂量添加、饲喂。 4、部分违法分子专门加价收购添加、饲喂瘦肉精的肉畜。,在畜牧
5、业生产中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质； 同时也造成动物性食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。 当人们食用含有盐酸克伦特罗（瘦肉精）残留的产品后会产生一定的中毒症状。,3、克伦特罗的毒性,心血管系统：心悸、心慌、头晕头痛等临床症状 神经系统恶心、呕吐、肌肉疼痛、肌肉颤抖、兴奋、不自主地颤抖、运动障碍 禁忌症 心脏病、糖尿病、高血压、青光眼、甲亢,中 毒 剂 量,人医用药量： 0.02 0.5 g/kg 中毒一般含量： 肝脏 100 500 g/kg 中毒极端含量： 肝脏 19 5395 g/kg,4、代谢和残留状况,半 衰 期,第一半衰期：10h 第二
6、半衰期：64.8h（2.5d）,用药剂量：16g/(kg.d) 持续时间：20d 停药与残留： 停药时间 肝脏残留浓度 0 d 73.8ng/g 15 d 2.4ng/g 35 d 0.7ng/g,日粮中添加2mg/kg CL停药后猪尿液中CL浓度变化,猪尿中CL的消除曲线,5、中毒事件,在互联网上用“瘦肉精中毒”搜索，可以查到有6710项的相关报道。世界上最早的“瘦肉精”中毒事件于1990年3月在西班牙发生。我国则于1998年5月在香港最早出现。 1、2003年8月22日，广东信宜市发生530人瘦肉精集体中毒事件 2、2002年2月浙江省平湖市170余名群众发生瘦肉精中毒 3、2001年11
7、月2日，北京发生14人瘦肉精中毒 4、 2001年11月，广东河源市发生484人食用含瘦肉精的猪肉后集体中毒的事件，闻名全国 5、1999年10月，浙江嘉兴市发生57人“瘦肉精”（含盐酸克伦特罗)集体中毒事件 6、1998年，广东高明市发现有7例因喝猪肺汤致人中毒事件,二、金标免疫试剂条原理介绍,利用了免疫层析的技术 特点： 1：检测速度快，515分钟就可知道结果。 2：不需要任何仪器设备； 3：操作简便； 4：灵敏度高，可达到ng级水平,两种金标检测试剂： 1、金标检测试剂条 2、金标检测卡,1、金标检测试剂的历史, 1971年由Faulk 和Taytor发明，目前在医学方面得到了日益广泛的
8、应用。 90年代传入我国，已经用于检测 HBsAg（乙肝）、HCG（早孕） 、HIV（艾滋病）、梅毒等疾病，具有简单、快速、准确和无污染等优点，我国已经有几十家药厂生产医学检验用的金标试纸。 目前，该项技术已开始应用于药物残留和疫病等的检测。,几个概念：,1、什么是抗原抗原是能刺激机体产生抗体（免疫球蛋白，Ig）,并能与产生的抗体发生特异性结合的物质。医学上重要的抗原有细菌（如NGH），病毒（如HBV、HCV、HIV），螺旋体（如TP），蛋白质（如AFP）等。2、什么是抗体？抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，是免疫应答的产物。它与相对应的抗原能发生特异性的结合（如锁与钥匙的关系一样，一
9、把钥匙开一把锁），与其他抗原不发生结合。 临床上的免疫学检测方法就是根据抗原抗体高度特异性结合的原理设计。可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体检测未知的抗原。,2、金标检测技术的基本原理,金标免疫检测试纸条系统使用一种特殊的多孔膜（NC膜）作为固相载体。该膜具有很强的蛋白吸附功能，抗体抗原吸附于NC膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应标记了胶体金的抗原抗体快速结合。 在湿润状态下，液相中的抗原抗体免疫金可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相另一抗原决定簇单抗结合，形成特异的金标记抗体抗原抗体红色沉积线，表现出抗原抗体的特征反应。,金标试纸条工作原理,是将各种反应试剂以条
10、带状固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触，样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。,金标免疫检测试纸条的结构,主体的膜反应体系由以下部分组成：1： 高蛋白亲和性的高分子纤维素膜（NC膜），为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果。2：选用有较强吸水能力的玻璃纤维，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并
11、帮助吸水。 3：吸附力较强的玻璃纤维，作为金标记物的固相载体。 4：吸收垫，吸水，牵引反应物的运动。5：塑料基板，作为反应体系的支撑物。,金标检测技术的基本原理,氯金酸(HAuCl4)在还原剂（柠檬酸）作用下，可使金离子还原成金原子，并聚合成一定大小的金颗粒，形成一种胶体溶液。把这种溶液称为胶体金。 胶体金具有很大的表面积，可将抗原、抗体等蛋白质吸附到胶体金颗粒表面。,吸附的机理是胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固的结合。,用还原法可以方便地把氯金酸制备成各种不同大小直径的金颗粒、金颗粒的大小不同，颜色也不同。,金溶胶颜色 蓝 紫 紫红 红 橙红 橙吸收峰(nm)
12、 220 240 535 525 522 518直径(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15 一般使用40 nm的金颗粒，因为灵敏度较高。,塑料底板,样品吸收垫,玻纤,纤维素膜,滤纸,金标试剂条示意图,金颗粒上标记抗原,克伦特罗分子,BSA,金颗粒,在玻纤上喷抗原标记的金颗粒,标记抗原的金颗粒,玻纤,在纤维素膜上喷克伦特罗抗体,纤维素膜,抗体,试剂条组装,被标记的金颗粒,抗体,样品垫,滤纸,克伦特罗金标试纸条的工作原理,加入样品,样品流动,样品中没有克伦特罗时：,T线,金颗粒上的克伦特罗和纤维素膜上的抗体结合，金颗粒聚集在一起，形成红色的条带，结果为阴性。,样品中有高浓度的克
13、伦特罗时：,由于样品中克伦特罗的分子数量很多，大大多于金颗粒上的克伦特罗，抗体上都结合了样品中的克伦特罗，而金颗粒不能结合到抗体上，造成金颗粒穿过抗体条带到滤纸上，纤维素膜上为白色。,克伦特罗分子,T线,样品中含有少量的克伦特罗时：如5ppb以下,样品中克伦特罗分子较少时，和交联在金颗粒上的克伦特罗互相竞争，有少量的金颗粒吸附在纤维素膜上，行成颜色较浅的T线。,T线,因此，随着样品中克伦特罗浓度由高到低，试纸上T线上的颜色由浅到深：,5ppb,1ppb,0.5ppb,0ppb,在医学上使用的各种金标试纸条，如艾滋病、乙肝、海洛因等检测试纸条，要求非常严格。纤维素膜上除喷上抗体形成T线（Test
14、）外，还喷有形成C线（Control）的抗体。 C线应在检测过程中的任何情况下都应该出现，否则就证明试纸条在运输、保存等过程中发生了意外情况，如高温、潮湿等，导致试剂条失效。这样就有了一个试剂本身质量的判定标准，避免由于试剂保存等原因造成的假阳性或假阴性等情况的出现。,T线,C线,这样，在高浓度的情况下，即使T线不出现，只要C 线出现，就知道试剂没有问题。而如果连C线都没有，则可知道是试剂有问题，该包装的试剂应该弃用。这样就避免了假阳性的结果。,检测原理示意图,胶体金颗粒表面包被有可以识别待测药物的抗体 检测线包被有药物-BSA偶联物，可以识别胶体金上的抗体 质控线包被有可结合胶体金颗粒的抗体
15、,三、 克伦特罗金标试剂的使用(杭州迪恩科技公司产品),产品包装：,每个锡箔袋中装5个测试卡； 两袋干燥剂防止试剂受潮; 每盒中装有12个锡箔袋，共60个测试卡，另外还装有60个塑料吸管。,产品可于室温下阴凉避光干燥处贮存，有效期12个月（无需在冰箱中保存）。 检测阈值：3ng/mL 检测不需要其它任何的辅助仪器,操作步骤1.检测准备,（1）根据检测样品和标准品的数量确定需要 的试纸条数量，并取出； （2）在金标试剂空白处写上样品编号。,写编号,2、操作步骤,第一步：在室温下，将测试卡平放在桌面上； 第二步：用试剂包装中所带的塑料吸管吸取尿液或其它提取样品； 第三步：在加样孔中滴三滴样品，5分
16、钟内判读结果。,3.结果判定,阳性（+）：仅质控区（C）出现一条紫红色带，在测试区（T）内无紫红色条带出现。表明尿液中的克伦特罗残留物大于3ppb。 阴性（-）：两条紫红色条出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区内（C）。表明尿液中不含克伦特罗残留物或尿液中的克伦特罗残留物小于3ppb。,阴性,阳性,未加样,操作示意图,结果判读,阴性（）：T 线和C 线都显色，表示样品中盐酸克伦特罗浓度低于检测限。 阳性（）：T 线无显色C 线显色，表示样品中盐酸克伦特罗浓度高于检测限。 无 效 ：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。,金标读数仪：美国产品可以进行定性和定量的检测分析；体积小，重量轻，便于携带；适合于基层应用单位使用,四、注意事项,1.检测前请详细阅读说明书并做好准备工作； 2.每加完一个样品必须更换移液
