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1、正德 利用 厚生 惟和 细胞克隆形成实验细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖 6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有 50 以上的细胞，大小在 0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的 独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定 的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都 能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成 率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细 胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞
2、克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转 化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法：实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干 细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 正德 利用 厚生 惟和 平板克隆形成实验基本步骤：平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用 0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 并把细胞悬浮在 10%胎牛血清的 DMEM 培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以
3、每皿 50、100、200 个细胞的梯 度密度分别接种含 10mL 37预温培养液的皿中， 并轻轻转动， 使细胞分散均匀。 置 37 5% CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养 23 周。 3、 经常观察， 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时， 终止培养。 弃去上清液， 用 PBS 小心浸洗 2 次。加 4%多聚甲醛固定细胞 5mL 固定 15 分钟。然后去固定液，加 适量 GIMSA 应用染色液染 1030 分钟， 然后用流水缓慢洗去染色液， 空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微 镜（低倍镜）计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆
4、形成率 =（克隆数/接种细胞数）100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不 能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不 能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：软琼脂培养克隆形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作 活细胞计数，用含 20%胎牛血清的 DMEM 培养液调整细
5、胞密度至 1106 细胞/L。 然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出 1.2%和 0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后， 维持在 40中不会凝固。 正德 利用 厚生 惟和 (3)按 1:1 比例使 1.2%的琼脂糖和 2DMEM 培养基(含有 2抗生素和 20%的小牛血 清)混合后，取 3mL 混合液注入直径 6cm 平皿中(10cm 平皿加 710mL)，冷却凝 固，可作底层琼脂置 CO2 温箱中备用。 (4)按 1:1 比例让 0.7%的琼脂糖和 2DMEM 培养基在无菌试管中相混以后，再向 管中加入 0.2mL 的细胞悬液，充分混匀，注入铺有 1.2%琼脂糖
6、底层平皿中，逐 形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入 37 5%CO2 温箱中培养 1014 天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养 法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超 过 40。接种细胞的密度每平方厘米不超过 35 个，一般 6cm 的平皿接种 1000 个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将 1.2低熔点琼脂糖与 2细胞培养基以 1:1 的体积比混合制备 0.6的底层琼 脂，6 孔板中每个孔 1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个
7、细 胞悬液，计数，并调细胞浓度为 10000 个/ml，将 0.6低熔点琼脂糖与 2细胞 培养基以 1:1 的体积比混合，制备 0.3的上层琼脂，每孔加 1ml 上层琼脂和 100ul 单细胞悬液（约 1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于 37，5CO2 的细胞培养箱中培养 23 周，计数含 50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形 成率，SpotII 采集图像。 注意事项注意事项 1.接种时细胞密度适度，不可过高。 2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过 40，否则将会烫伤/死细胞； 3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此 高压灭菌后应进行分装； 4
8、.细胞在进行克隆形成实验时要求有 95%以上的分散度，否则结果的准确度会受 正德 利用 厚生 惟和 到很大影响； 5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克 隆形成率可达到 10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为 0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培 养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 6.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个 都能增殖和形成克隆。 做克隆形成率测定时， 接种细胞一定要分散成单细胞悬液， 直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
