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1、生理学实验 2009.12.09 1 实验名称：实验名称： 蛙类离体心脏灌流蛙类离体心脏灌流 课程名称：课程名称： 生理学实验生理学实验 指导教师：指导教师： 龙天澄龙天澄 张碧鱼张碧鱼 陈笑霞陈笑霞 实实 验验 人：人： 叶永锋叶永锋 08344031 学学 院院 ： 海洋学院海洋学院 实验时间：实验时间： 2009 年年 12 月月 09 日日 生理学实验 2009.12.09 2 一、 【目的要求】一、 【目的要求】 1、学习斯氏离体蛙心灌流法。 2、了解心肌的生理特性。 3、观察 Na+,K+,Ca2+及肾上腺素(Adr),乙酰胆碱(ACh)等对离体心脏活动的影响。 二、 【原理】二、
2、 【原理】 将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保 持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体 心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分， 观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性，都与钠、钾及钙 等离子有关。血钾浓度过高时（高于 7.9mmol/L） ，心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性 都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。血钙浓度 升高时，心脏收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。 血中钠
3、离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影响心肌的生 理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作 用相反。 三、 【实验仪器】三、 【实验仪器】 青蛙、 常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双 凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙 心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、065NaCl、5NaCI、2CaCl2、1KCl、1： 5 000 肾上腺素、1：10 000 乙酰肌碱、300UmL 肝素。 四、 【方法与步骤】四、 【方法与步骤】 1、斯氏蛙心插
4、管法 （1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中， 按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大 血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉 圆锥处结扎(动物个体小时，结扎位置可靠上些)。再 从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结 备用。 左手提起主动脉上的结扎线， 右手用眼科剪在结 扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。 选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量(套管内 23 cm高度)任氏液(内加入一滴肝素溶液)的斯 氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥(见右图)。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管 稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内(于 心室收缩时插入
5、，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人 套管，并使液面随心脏搏动而亡下移动，表明操作成功(否则需退回并重新插入)。用滴管吸 去套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同 插入的套管用双结扎紧(不得漏液)，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上 方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅 保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室内余血， 生理学实验 2009.12.09 3 使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管 内液面高度一致(1.52 cm)，即可
6、进行实验。 （2） 将插好离体心脏的套管固定在支架上， 用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过 多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的 系 线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右 图） 。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节 显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。 2、 实验观察 (1)记录正常心搏曲线 (2)改用 065NaCI 溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线 氏插管装 置出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗 23 次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保 持灌流液面一致(以下同)。 观察可得，NaCI 溶
7、液会阻遏心脏搏动。 (3)向套管内加 26 滴 5NaCI(较细的套管需少加)溶液，作好加药记号，观察心搏曲 线的频率及振幅变化。 当曲线出现明显变化时， 应立即吸去套管中的灌流液， 并做好冲洗标 记，迅速用新鲜任氏液清洗 23 次，待心搏恢复正常。 (4)同法向套管内加入 13 滴 2CaCI：溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明 显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常(如果恢复迟缓，可多次冲洗)。 (5)向套管中加 12 滴 1KCl 溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法 更换灌流液，待心搏恢复正常。 (6)同法记录套管中加入 l2 滴的肾上腺素溶液(1：10 000)后
8、心搏曲线的变化。 (7)同法记录套管中加入 12 滴乙酰胆碱溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。 3、实验结果与分析 将记录到的各段心搏曲线附在实验报告中， 计算给药前后曲线的频率、 振幅和基线变化。 测量结果填入表中。 五、 【实验结果】五、 【实验结果】 1、正常博击曲线图、正常博击曲线图 生理学实验 2009.12.09 4 2、滴加、滴加 0.65%NaCl 溶液图溶液图 分析 ： 滴加 0.65%NaCl 溶液后，心跳减弱，这是由于用 0.65%NaCl 溶液灌注蛙心时，由 于灌注液中缺乏 Ca2+，以致心肌细胞动作电位 2 期内流 Ca2+减少，细胞质 Ca2+浓度减少， 心
9、肌的收缩活动也随之减弱。 3、 滴加、 滴加 5%NaCl 溶液溶液 生理学实验 2009.12.09 5 分析：由于细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。因此上图的 心率变化与图 2 滴加 0.65%NaCl 溶液里变化并不是很大， 两个不同浓度的相同溶液作用机理 是一样的， 在此一不作过多相同分析。 但如果实验中滴加溶液顺序不一样， 若先滴加 5%NaCl. 再滴加 0.65%NaCl 溶液， 所得的心搏变化就不如图 3 那样明显了， 收缩力仅出现很微弱的变 化。 4、 滴加 2%CaCl 溶液4、 滴加 2%CaCl 溶液 分析：细胞外 Ca2在细胞膜上对 Na内流有竞争
10、性抑制作用，称为膜屏障作用。Ca2 0增高时， Na内流受抑制， 细胞 0 期除极速度与幅度减小， 使兴奋性及传导性均降低。 Ca2 0增高使 Ca2内流增多，因此慢反应细胞 0 期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞 平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca2内流增多，使心肌收缩能力增强。Ca2 0降低时， 所引起的变化与高钙时相反。 因此加入 CaCl2后， 心率减少、 振幅减少， 基线上移。 5、 滴加 1%KCl 溶液5、 滴加 1%KCl 溶液 分析 ： 滴加 1后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下KCl 降，最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当
11、细胞 K+浓度增高时，K+与 Ca2+有 竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对 Ca2+的转运，使进入细胞内 Ca2+减少，心肌的兴奋收 生理学实验 2009.12.09 6 缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。 6、 滴加 1：10000 肾上腺素溶液6、 滴加 1：10000 肾上腺素溶液 分析 ： 滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显增大。 其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的 B 受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜 Ca2+ 通透性，导致肌浆中 Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白 与 Ca2+亲和力，促使肌钙蛋
12、白对 Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取 Ca2+的速度，刺 激 Na+与 Ca2+交换， 使复极期向细胞外排出 Ca2+的作用加速， 这样， 将使心肌舒张速度增快， 整个舒张过程明显增强。 7、 滴加 1：10000 乙酰胆碱溶液7、 滴加 1：10000 乙酰胆碱溶液 分析：上图可示，蛙心收缩减弱，心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为： 乙酰胆碱与心肌细胞膜 M 受体结合， 一方面提高心肌细胞膜 K+通道的通透性， 促使 K+外流， 将引起：1）窦房强细胞复极时 K+外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik 衰减过程减弱， 生理学实验 2009.12.09 7 自动除极速度减慢
13、。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中 K+外流 增加，动作电位 2、3 期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱 可直接抑制 Ca2+通道，减少 Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。 表一：各测量结果比较表一：各测量结果比较 表 1 改变灌流成分对蛙离体心脏活动的影响 实验项目 心率/（次 /min） 振幅/g 基线变化 （上移或下移） 其他 对照521.47 给药511.47心收缩力减弱 0.65 NaCl 恢复521.8 对照521.8 给药512.82上移心收缩力减弱5NaCl 恢复622.6 对照491.65 给药492.16上移 收缩力没有
14、明显增 大， 但基线上移明显 2 2 CaCl 恢复501.94上移 对照522.27 给药591.91稍上移心收缩力减弱1KCl 恢复582.05 对照511.83 给药512.64心收缩力增强 110000 肾上腺素 恢复552.67 对照461.06 给药01.06心收缩力减弱 110000 乙酰胆碱 恢复520.77上移 六、 【注意事项】六、 【注意事项】 1. 制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。 2 .上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损，而且必须待心 搏恢复正常后方能进行下一步实验。 3. 复习心肌生物电的产生机制及各种离子对心脏活动的影响。 4. 尽量选
15、用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。 5. 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。 6. 每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量变化而影响结果。 7. 严格控制每次药品加入量，先加一滴，效果不明显再加一滴。 8. 滴加药品和换取正常任氏液，须及时标记，以便观察分析。 9. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用，以免影响实 验结果。 【思考题】【思考题】 生理学实验 2009.12.09 8 1. 离体蛙心制备好后，有时候馆内的液面上下移动很不明显，是何原因？如何处理？1. 离体蛙心制备好后，有时候馆内的
16、液面上下移动很不明显，是何原因？如何处理？ 答：离体蛙心制备好后，蛙心插管内的液体应随蛙心室的收缩和舒张活动而上下移动。 其实质是 ： 在心室收缩时，心室容积减少，室内压升高，将心室内的液体压入插管内，管内 液面上升 ； 在心室舒张的时候，心室容积增大，心室内压减少，将插管内液体吸入心室，管 内液面下降。 但是有时候蛙心插管内液面波动不明显，其主要原因是： 插管内尖端出现血凝块。插管内液体不能顺畅的进出心室腔内。解决方法为用长吸 管将血凝块吸出，在吸出血凝块后，应立即用新鲜任氏液换洗插管内液体几次，直至蛙心颜 色变淡，插管内无血液和小血块为止。 插管尖端不在心室腔内，而是在心房或者脉间结缔组织等地方。解决方法为将插管 重新插入心室，确定无误后，再结扎固定。 插管进入心室腔内过深，以致尖端抵住了心室壁。解决方法为将插管稍稍外提，使 插管口正好处于心室腔内，且开口正对着液体喷射的轴流方向。 蛙心由于长期心肌失血，导致活力下降。解决方法为向插管内滴加少许肾上腺素或 者对其进行外加力使其起搏，使其活动增强。 房室传导
