分子印迹技术原理及其在分离提纯上的应用-修订编选

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1、生物分离的新技术分子印迹生物分离的新技术分子印迹 创新论坛工业生物技术专家报告会 2008 级生命学院 3 班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣 2008001243 宋汉臣 1 目 录目 录 1 分子印迹技术的原理与方法分子印迹技术的原理与方法3 1.1 MIP 的制备过程的制备过程3 1.2 制备制备 MIP 的方法的方法3 1.2.1 预组装法共价键作用4 1.2.2 自组装法非共价作用4 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法5 2 分子印迹技术在分离上的应用分子印迹技术在分离上的应用5 2.1 MIP 作为固定相的分离技术作为固定相的分离技术6 2.1.1MIP 作为

2、固定相分离天然产物6 2.1.2MIP 作为固定相检测食品中药物的残留7 2.2分子印迹膜分子印迹膜(MIM)分离技术分离技术7 3 问题与展望问题与展望8 4 参考文献参考文献9 2 摘要摘要：分子印迹技术1(Molecular Imprinting technique，MIT)是一种新的、很有发展潜力的 分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用 范围广等优点，分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品 工业等众多领域，在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显 示出良好的应用前景， 引起了人们的广泛关注， 其有望在三聚氰胺

3、的快速痕量检测上 发挥作用。 关键字：关键字：分子印迹 生物分离 分子印迹聚合物 3 前言： 分子印迹技术最初出现源于 20 世纪 40 年代的免疫学，当时 Pauling3首 次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础， 1993 年 Mosbach 等人 有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟 及色谱固相分离等方面有了新的发展，得到世界注目并迅速发展。基于该技术制 备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使 用寿命长、应用范围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固 相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜

4、分离等领域得到日益广泛的 研究和开发，有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行 业形成产业规模化的应用。 目前， 全世界3至少有包括瑞典、 日本、 德国、 美国、 中国、澳大利亚、法国在内的 10 多个国家、100 个以上的学术机构和企事业团 体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。 4 分子印迹技术是近年发展起来的一种新方法2，它可为人们提供具有期望结构的性质 的分子组合体。 当体系中存在着模板分子时， 功能单体可以通过聚合使这些模板分子以互补 的形式固定下来。聚合后，模板分子可被除去，于是在这一过程中，体系变动的“快照”就 可被“拍摄”或记录下来，此对模板分子具有“记忆”功能

5、，再遇到模板分子时就表现出独 特的识别性能。从而使获得的分子组装体能专一性地键合模板分子以及它的类似物。 1 分子印迹技术的原理与方法1 分子印迹技术的原理与方法 分子印迹技术是指制备对某一特定分子具有选择性识别能力的聚合物的技术。 模板分子 与功能单体相互作用形成超分子复合物，再在交联剂作用下形成聚合物 ； 当在一定条件下除 去模板分子后，即可得到分子印迹聚合物(MIP)MIP)4。 1.1 MIP 的制备过程1.1 MIP 的制备过程5 MIP 的制备过程主要由如下 4 步构成： （1）印迹分子与功能单体通过共价或非共价键作用相互结合，形成印迹分子-单体配合物 （图 1 步骤 3） （2）

6、在配合物中加入交联剂，受引发剂、热或光引发，印迹分子-单体配合物周 围产生聚合反应。在此过程中，聚合物链通过自由基聚合将模板分子和单 体配 合物“捕获”到聚合物的立体结构中。常用交联剂有：双甲基丙烯酸乙二醇酯、季戊 四醇三丙烯酸酯、三甲氧基丙烷、三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯等。 （图 1 步骤 4） （3）洗脱6印迹分子，得到印迹聚合物，形成含有与印迹分子形状和功能基团排列相匹配 的空穴。分子印迹的 3 个过程可用图 1 来描述。（图 1 步骤 5）因此 MIP 对印迹分子 有“记忆”功能，对其具有高度的选择性。 图 1 分子印迹示意图3 (4) 后处理。 在适宜的操作条件下对印迹分子聚合物进行

7、成型加工和真空干燥等后处理。 所 制备的分子印迹聚合物应具备良好的物理化学和生物稳定性、高吸附容量和使用寿命、 特定的形状尺寸，以获得较高的应用效率。 1. 2 制备 MIP 的方法1. 2 制备 MIP 的方法2 根据印迹分子和功能单体之间的作用可将制备 MIP 的方法分为以下三种： 1. 2.1 预组装法 (Pre-organized approach)共价键作用1. 2.1 预组装法 (Pre-organized approach)共价键作用 共价键法是由 Wullf 等人创立发展起来的。 该方法中印迹分子 (目标分子 )和功能单体 以共价键的形式结合生成单体模板配合物，单体模板配合物于

8、交联剂反应生成聚合物 5 后，进一步在化学条件下打开共价键使印迹分子脱离。此时形成的共价键既稳定又可逆，这 似乎是相互矛盾的双重特性，所以注定了其生成的分子稳定性高、抗性好、选择性强，但产 物的洗脱困难的特性。 共价键法主要应用于制备各种具有特异识别功能的聚合物， 如糖类及 其衍生物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、香酮、醛类及甾醇类物质。 1.2.2 自组装法（Self-assembly approach）非共价作用1.2.2 自组装法（Self-assembly approach）非共价作用 非共价键法是由 Mosbach 等人发展起来的， 即把适当比例的印迹分子与功能单体和交联 剂混

9、合， 通过非共价键结合在一起生成非共价键印迹分子聚合物。 非共价作用不必合成共价 的单体-模板配合物，可在温和的条件下很快的将模板从聚合物中除去，拥有较快的反应速 度，但这些也恰恰反映了非共价作用的缺点 ： 选择特异性不强、生成的聚合物不稳定。此法 主要应用于下列物质的分离中: 染料、二胺、维生素、氨基酸衍生物、多肽、肾上腺素功能 药物阻抑剂、茶碱、二氮杂苯、核苷酸碱基、非甾醇类抗感染药莱普生和苄胺等。 共价键法和非共价键法的主要区别在于 ： 单体与模板分子的结合机理不同，非共价键法 中通过弱的相互作用力在溶液中自发地形成单体模板分子复合物， 而共价键法是通过单体和 模板分子之间的可逆性共价键

10、合成单体模板分子复合物的，见(图 13)3。 图 13 共价作用与非共价作用过程3 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 近来 Vulfson 等人又发展了一种称之为“牺牲空间法 ( sacrificial spacer method)”的分 子印迹技术。 该法实际上是把分子自组装和分子预组织两种方法结合起来形成的方法， 其制 备过程如图 14 所示。 图 14牺牲空间法示意图 模板分子与功能单体以共价键的形式形成模板分子的衍生物(单体模板分子复合物)， 这一步相当于分子预组织过程，然后交联聚合，使功能基固定在聚合物链上，除去模板分子 后，功能基留在空穴

11、中。当模板分子重新进入空穴中时，模板分子与功能单体上的功能基不 是以共价键结合，而是以非共价键结合，如同分子自组装。那么整个过程也就是制备时模板 分子与功能单体共价结合， 反应时底物分子和聚合物非共价结合。 这样就同时拥有了稳定性 6 高、抗性好、选择性强等预组装法过程的优点，和反应快，易分离的自组装法优点。 2 分子印迹技术在分离上的应用7 7 MIP 具有良好的操作稳定性和特异的识别性质，不受酸、碱、热、有机溶剂等各种环境 因素影响的特点。 MIP 的印迹分子范围广阔， MIP 的最重要的用途之一就是用于分离混合物，MIP 用于分离中最主要的用途之一是作为色谱固定相， 并已用于高效液相色谱

12、 (HPLC)、 毛细管电 色谱(CEC)、以及薄层色谱 (TLC)分离中，还用于膜分离、固相萃取等重要分离技术。 2.1 MIP 作为固定相的分离技术2.1 MIP 作为固定相的分离技术 分子印迹固相萃取具有：对目标物能选择性吸附；能耐高温高压、耐有机溶剂；重复使 用次数高等优点。 自从Sellergren8于1994年将MIPs用于戊脒的固相萃取以后， 基于MIPs的 固相萃取(MISPE)技术已被广泛应用于药物、生物、食品、环境样品分析，作为监测药物生 物大分子、烟碱、除草剂、农药、硝基酚等的前处理 2.1.1MIP 作为固定相分离天然产物2.1.1MIP 作为固定相分离天然产物 天然产

13、物有效成分含量低，难于富集 ； 体系复杂，大分子和小分子、生命和非生命物质 共存，存在结构相近的异构体，分离纯化难度大；许多天然产物具有热敏，易水解等特点。 将MIP应用于中药成分的分离纯化就是以待分离的化合物为印迹分子(也称模板、底物)，制 备对该类分子有选择性识别功能的MIPs， 然后以这种MIPs作为吸附材料用于中药成分的分离 纯化。 其最大的特点是分子识别性强， 选择性高， 成本低， 而且制得的MIPs有高度的交联性， 不易变形， 有良好的机械性能和较长的使用寿命， 这无疑是一种高效的中药有效成分分离技 术。 尹艳凤9等以大黄素分子为模板,甲基丙烯酸为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂

14、, 甲苯和十二醇为混合致孔剂,在优化的合成条件下制得的分子印迹整体柱能有效地分离大黄 素及其类似物。程绍玲10将MIP用于葛根提取物的分离，有效地从葛根提取物中分离出葛根 素、 大豆苷元和大豆苷， 并且所得产品中葛根素纯度为78 ， 收率为83 ， 远要高于普通大 孔吸附树脂对葛根提取液的分离结果。雷启福11等制备了以没食子儿茶素没食子酸酯为模 板分子，采用本体聚合法制备了分子印迹聚合物，研究了其特异的分子识别能力，利用聚合 物的高选择性和结合能力， 对茶叶提取物茶多酚中有效成分进行固相萃取剂分离富集， 实现 了产物的色谱分离检测。 长春碱与长春新碱具有很高的理化相似性很难分离， 冯建涌等12

15、将制备的长春碱 （VLB） 分子印迹聚合物填充于固相萃取小柱中，用甲醇:冰醋酸（6：4，v/v）为溶剂抽提聚合物， 抽提后的聚合物通过氢键等非共价键作用能特异性地吸附模板分子VLB， 而对VLB的结构类似 物长春新碱没有选择性。向海艳13以白藜芦醇为模板分子合成了对天然活性物质白藜芦醇 具有较好选择性的MIPs，对白藜芦醇有较高的吸附性能和选择性 ： 将虎杖提取物经白藜芦醇 MIPs固相萃取， 得到主要含白藜芦醇及少量结构与其相似的白藜芦醇苷组分， 显示出分子印 迹分离法在中药有效成分分离纯化中可喜的应用前景！ 2.1.2MIP 作为固定相检测食品中药物的残留2.1.2MIP 作为固定相检测食

16、品中药物的残留 食品安全性问题日益突出，食品中农药、兽药残留等问题已对环境造成污染，给人类带 来危害， 最近的三聚氰胺事件再一次为食品检测敲响警钟。 许多食品样品的基体和组成相当 复杂，被分析物处于痕量状态，易受到干扰。MIPMIP具有优越的识别性和选择性。我国非常重 视此项技术的研究和发展，“十一五”开局的2006年，国家863计划将分子印迹技术在食品 中农药、 兽药残留检测领域的应用作为重点技术进行支持， 并以现代农业技术领域专题的形 式进行立项。 乐果是一种高效广谱性杀虫杀螨剂,具有强烈内吸和触杀作用,对害虫击倒快， 对人、 畜 毒性较高。 2007 年北京化工大学的 Lv Yongqin14“研究了以杀虫剂乐果(dimethoate)为模 板分子制备乐果印迹聚合物， 并用该印迹聚合物装填的固相萃取柱对茶叶中的农药乐果进行 7 了分离纯化，获得了满意的效果，加标的乐果样品在 MISPE 柱中的回收率达 10