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1、.,1,上海汉尼生物技术有限公司 李燕燕 产品经理,灭菌方法与生物指示剂,2,概要,灭菌法和生物指示剂 生物指示剂的形式 无菌保证水平 灭菌工艺验证 常用灭菌方法 制药工业常用的灭菌方法 生物指示剂的使用 孢子数测定,3,灭菌法和生物指示剂,灭菌法 系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。,生物指示剂 系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。,4,生物指示剂的形式,一定数量的孢子附着在惰性载体上， 如滤纸条、玻片、不锈钢、
2、塑料制品等 孢子悬浮液密封于安瓿中,5,无菌保证水平,无菌保证水平 一批物品的无菌特性只能相对地通过物品中活微生物的概率低至某个可接受水平来表述，即SAL（sterility assurance level）。,我国及欧美药典都把SAL不得大于百万分之一作为最终灭菌产品无菌保证的要求，即SAL106,6,灭菌工艺验证,验证一个灭菌工艺系统能否使产品灭菌后达到无菌要求, 通常认为灭菌后微生物残存概率小于110-6。 物理性验证：通过得到的热分布与热穿透数据, 来估测一个灭菌程序对微生物的致死性。 化学指示剂验证：物品包外用化学指示剂用于验证物品是否经过灭菌处理，物品包内中心部位的化学指示剂才可作
3、为物品是否达到灭菌的参考标志。 生物指示剂验证：将已知其耐热性的生物指示剂直接接种在产品溶液或相似溶液中进行验证, 是评判灭菌工艺杀灭效果最直观有效的方法, 也是灭菌工艺验证必不可少的试验。,7,常用的灭菌方法,湿热灭菌法 干热灭菌法 气体灭菌法 辐射灭菌法 过滤除菌法,8,不同灭菌方式不同的菌种种类的选择,9,湿热灭菌法,指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。,须保证物品灭菌后的SAL10-6 对热稳定的物品，可采用过度杀灭法， 其SAL应10-12,10,适用范围,药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其它遇高温和潮湿不
4、发生变化或损坏的物品,11,常用的生物指示剂,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953 ) D值为1.53.0min 生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes，NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955 ） D值为0.40.8min,12,生物指示剂的选择,13,干热灭菌法,指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。,保证灭菌后的产品其SAL10-6 干热过度杀灭后产品的S
5、AL应10-12,14,耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等,适用范围,15,枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，NCIMB 8058、ATCC 9372 ),常用的生物指示剂,D值大于1.5min,16,生物指示剂的选择,17,气体灭菌法,指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。在充有灭菌气体的高压腔室内进行。,常用气体：环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛等,18,环氧乙烷法,灭菌原理：强氧化，其分子作用于菌体后，能与菌体蛋白、核酸和酶中的COOH、NH2、SH、OH等基团起反应，而使菌体死亡。,具
6、有杀菌谱广，灭菌能力强的特点，对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。,19,适用范围,塑料包装的原料粉末、散剂、颗粒等固体药料及医疗器械类固体器具等不能采用高温灭菌的物品的灭菌 含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用,20,常用生物指示剂,枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，NCTC 10073、NCIMB 8058、ATCC 9372 ),D值大于2.5min,21,气态过氧化氢法,是利用过氧化氢在低浓度的气体状态下比液体状态更具杀孢子能力的优点，经生成游离的-OH，用于进攻细胞成分，包括脂类、蛋白质和DNA，达到完全灭菌的要求的一种技术。,22,
7、应用： 隔离器的验证 新设备或灌装线的调整和认证 大型或组装设备的评估 未知气体分布动力学研究 含有多个装载配置的设备认证 设备中最难灭菌位置的日常检测 生物指示剂：嗜热脂肪芽胞杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953 ),23,生物指示剂的选择,24,辐射灭菌法,应用射线、射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。,射线灭菌机理：射线直接作用于微生物的蛋白质、核酸和酶等，促使化学键断裂，杀死微生物；又
8、可间接作用于微生物体内的水分子，引起水的电离和激发，生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。 对于辐射灭菌，无芽孢菌比有芽孢菌敏感得多；无芽孢菌中革兰氏阴性菌比阳性菌敏感；而病毒敏感性很差。,25,适用范围,不耐热药物的灭菌，医疗器械、容器、高分子材料、包装材料、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。,26,常用生物指示剂,短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。,置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。,27,过滤除菌法,系利用细菌不能通过致密具孔
9、滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。,适用范围： 对热不稳定的药物溶液、气体、水或原料的除菌。,28,常用生物指示剂,滤膜孔径为0.22m的滤器 ：缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta, 如ATCC19 146) 滤膜孔径为0.45m的滤器 ：黏质沙雷菌(Serratinmarcescens, 如ATCC 14 756),29,制药工业常用的灭菌方法,原料药： 化学合成药较高熔点药物常用于干热灭菌法，对较低熔点的则用湿热灭菌法 ，对不耐热药物，如是晶体，可溶解后过滤除菌 ； 植物提取物若是用常规或高温提取的单一成分的流浸膏，常用压力蒸汽法、流通蒸汽法消毒灭菌；若是低温提
10、取物，则优先考虑过滤除菌； 生化药物化学消毒灭菌剂，如低温乙醇法、低温间歇法和过滤法等。,30,药品制剂： 输液剂和水针剂压力蒸汽灭菌法； 热不稳定药物如冻干粉针剂过滤法； 多数药液射线灭菌。 软膏等半固体制剂：干热法或辐射法 中药： 大部份药材压力蒸汽法； 除含挥发油、对热不稳定成分的药材和生、熟功效不 同的药材热力法和辐射法。,31,抗生素生产： 培养基、种子罐和发酵罐压力蒸汽法； 无菌空气过滤法； 最终产品过滤法。 水和空气： 过滤法、甲醛蒸气法。 包装材料： 玻璃材质的安瓿、西林瓶干热法； 聚乙烯、聚丙烯等塑料包装材料等100蒸汽； 橡胶塞等湿热法。,32,厂房设施、设备和工器具： 不
11、锈钢制密闭设备、管道压力蒸汽； 小的设备零部件、工器具和容器干热法或湿热法； 耐酸碱而不耐高温的塑料材质物品过氧化氢法； 洁净工作服、清洁工具压力蒸汽法。,33,常用灭菌方法汇总,34,35,36,生物指示剂的使用,选择合适的生物指示剂 正确使用生物指示剂 放置位置、数目、放置的方式 使用之后的处理,37,选择合适的生物指示剂,38,生物指示剂的放置位置,应放在灭菌最困难的地方： 在灭菌器中最大包装的中心； 灭菌器排气口，往往不易达到灭菌温度； 靠灭菌器的门口和底部； 不同的生物指示剂摆放要求不同。,39,根据设备规格调整指示剂数量，建议不少于2支，一般每个灭菌周期使用不少于10支。 冷藏保存的生物指示剂使用前须室温放置1-2小时。,生物指示剂的放置数目,40,至少一支未灭菌的作为阳性对照 阳性结果都要高压灭菌后才可丢弃 有些BI含有阴性对照的，需要一同灭菌后培养,正确使用生物指示剂,41,孢子数测定,1.涡旋振荡仪将纸片浸渍混匀直至成匀浆 2.热击10-15min、冰浴2min 3.系列稀释，每次移液前需振荡混匀 4.TSA 浇注法适宜温度倒置培养48h 5.计数 为验证说明书上的孢子数，根据美国药典及ISO 11138 ，恢复的孢子数所占的百分比应为50%+300% 。,42,枯草芽孢杆菌孢子数的测定,恢复率=94%,.,43,Thank You!,shharmony,
