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1、(19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利 (10) 授权公告号 (45) 授权公告日 (21) 申请号 201910348878. 7 (22) 申请日 2019. 04. 26 (65) 同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 110093324 A (43) 申请公布日 2019. 08. 06 (83) 生物保藏信息 CCTCC NO:V201924 2019.04. 11 CCTCC NO:V201925 2019.04. 11 (73) 专利权人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究 所( 中国动物卫生与流行病学中 心哈尔滨分中心) 地址 150069 黑龙江省哈尔滨市
2、香坊区哈 平路678号中国农业科学院哈尔滨兽 医研究所 (72) 发明人 步志高 陈伟业 赵东明 何希君 刘任强 柳金雄 (74) 专利代理机构 北京商专永信知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11400 代理人 方挺 黄谦 (51)Int.Cl. C12N7/01(2006. 01) A61K 39/12(2006. 01) A61P 31/20(2006. 01) C12R1/93(2006. 01) 审查员 吕健 (54) 发明名称 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫 苗的应用 (57) 摘要 本发明涉及可作为疫苗的基因缺失减毒非 洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法。本发明采用非 洲猪瘟
3、中国流行株 Pig/CN/HLJ/2018 ，经基因工 程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得 MGF360 - 505R 缺失和 CD2V 与MGF360 - 505R 联合缺 失的基因缺失病毒。 经实验表明所述两种毒株均 能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100免疫 保护， 可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫 情的疫苗，具有极大的社会价值。 权利要求书 1页 说明书12页 序列表2页 附图3页 CN 110093324 B 2020.02.18 C N 1 1 0 0 9 3 3 2 4 B 1 / 19 1. 一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒， 其特征在于， 将基因II 型的非洲猪瘟病毒
4、的 MGF360 -505R 基因缺失病毒，并且所述MGF360 -505R 基因缺失病毒相对于原始毒株全长序列 缺失了第27942- 35500 位核苷酸； 或CD2V 与MGF360- 505R 基因联合缺失病毒， 所述基因II 型的非洲猪瘟病毒是全长基因 组序列如GenBank:MK333180.1中所述的中国流行株Pig/CN/HLJ/2018；并且所述CD2V 与 MGF360 - 505R 基因联合缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第 27942- 35500 位和第 73394-74476 位核苷酸。 2. 根据权利要求1所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，所述MGF3
5、60 - 505R 基因缺失病毒，保藏号为CCTCCNO:V201925 。 3. 根据权利要求1所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒， 其特征在于， 所述CD2V 与 MGF360 - 505R 基因联合缺失病毒， 保藏号为，CCTCC NO:V201924 。 4. 一种非洲猪瘟疫苗， 其特征在于，其含有根据权利要求1至3任一项所述的基因缺失 减毒非洲猪瘟病毒。 5. 一种制备根据权利要求1至3任一项所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒的方法，其特 征在于: 通过基因工程手段将原始毒株的第27942- 35500 位核苷酸缺失， 或者将第27942 - 35500 位和第73394 - 74476 位
6、核苷酸联合缺失以制备基因缺失减毒非洲猪瘟病毒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110093324 B 2 / 19 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用 技术领域 0001 本发明涉及兽医领域， 具体为动物疾病预防和治疗， 更具体涉及减毒的非洲猪瘟 病毒和疫苗。 背景技术 0002 非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成员，并且主要在细 胞的细胞质中复制。 非洲猪瘟是家猪和野猪的一种急性、烈性、 高度接触性传染病， 强毒株 可在感染的约5 - 14天内杀死家猪， 其中死亡率接近100， 无有效预防疫苗， 无特效治疗药 物。 各阶段家猪、野猪和软蜱是非洲
7、猪瘟自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播， 也可通 过蜱虫叮咬传播， 还可以通过污染了病毒的泔水、 饲料以及腌制的干火腿等猪肉产品跨国 家和地区传播。发现疫情，必须进行扑杀，是全球防范内危害猪群最严重的传染病之一，是 我国重点防范的头号外来动物疫病。 0003 我国生猪养殖占世界50以上。 根据非洲猪瘟在全球范围内流行发展特点及我国 生猪养殖业现状， 非洲猪瘟疫情将在我国进一步扩大并长期存在。一是由于我国生猪养殖 量巨大， 整体养殖水平低，生物安全防范条件差， 生猪跨区域调运频繁， 且存在野生宿主，为 非洲猪瘟疫情的传播提供了便利条件。二是周边国家疫情国家逐年增多，存在自然疫病病 源地。 三是
8、根据国外非洲猪瘟疫净化根除历史看，一旦发生非洲猪瘟疫情， 要彻底根除，均 需要花费漫长的时间， 并付出重大的代价。 因此， 必须加快开展非洲猪瘟流行病学、相关致 病机制、 快速诊断检测技术产品和防治疫苗的研究，并做好长期应对复杂的非洲猪瘟疫情 防控的技术和政策部署。 根据我国国情和已有病毒病防控经验，疫苗是防控非洲猪瘟疫情 最为有效和经济的方法， 研制有效、安全的疫苗十分迫切！ 尤其是2018 年8月初我国爆发非 洲猪瘟疫情，截至2019 年1月14日，已有24个省份发生过疫情， 扑杀生猪超过91.6万头， 造成 直接经济损失数十亿元， 间接损失无法计量， 给我国生猪养殖业和国民经济带来巨大损
9、失。 由于在我国首次发生， 缺乏对非洲猪瘟的系统科学认知和有效防控技术体系，仅能依靠扑 杀、 消毒等措施进行防控，给疫情防控带来了极大困难。 0004 非洲猪瘟病毒自从发现100多年来， 采用传统疫苗研制策略Forman， A.J. ， R.C.Wardley，and P.J.Wilkinson ， The immunologicalresponseofpigsand guinea pigstoantigensofAfricanswine fevervirus.ArchVirol ， 1982.74(2 - 3)： p.91 - 100； Mebus ，C.A.，Africanswinefev
10、er.AdvVirusRes ，1988.35：p.251 - 69； Stone， S.S.andW.R.Hess ，AntibodyresponsetoinactivatedpreparationsofAfrican swine fevervirusinpigs.Am J Vet Res ， 1967.28(123)：p.475 - 81.( 包括灭活疫苗、 自然弱毒或传代致弱疫苗等)、 新型佐剂Blome， S.，C.Gabriel ， and M.Beer ，Modern adjuvantsdo notenhance the efficacyof an inactivatedAfric
11、answine fever virusvaccinepreparation.Vaccine ， 2014.32(31)：p.3879 - 82. 和亚单位疫苗等新型疫 苗Jancovich ，J.K. ，etal. ， ImmunizationofPigsby DNAPrime and Recombinant VacciniaVirusBoostTo IdentifyandRank AfricanSwineFeverVirus 说明书 1/12 页 3 CN 110093324 B 3 / 19 Immunogenicand ProtectiveProteins.JVirol， 2018.92
12、(8)； Gomez - Puertas，P.， et al. ， The Africanswinefevervirusproteinsp54and p30areinvolvedintwo distinctstepsofvirusattachmentand bothcontributetotheantibody- mediatedprotectiveimmune response.Virology ， 1998.243(2)： p.461 - 71； Neilan， J.G.，etal. ， NeutralizingantibodiestoAfricanswinefevervirusprote
13、ins p30， p54， and p72 are not sufficientforantibody -mediated protection.Virology， 2004.319(2)： p.337 - 42；Ruiz - Gonzalvo ， F.，F.Rodriguez， and J.M.Escribano， Functionaland immunologicalpropertiesofthebaculovirus- expressed hemagglutininofAfricanswinefevervirus.Virology， 1996.218(1)： p.285 - 9； Lac
14、asta，A.， etal. ， Expressionlibraryimmunizationcan conferprotection againstlethalchallengewithAfricanswine fevervirus.J Virol ， 2014.88(22)： p. 13322- 32. 等研制策略，均未成功，使得该疫病多年来到处肆掠， 从非洲向全世界范围蔓 延。 紧靠扑杀策略，仅仅有西班牙、巴西等屈指可数的国家成功控制住非洲猪瘟。但由于我 国猪饲养量巨大， 仅仅靠扑杀手段， 成本太高，安全、 有效的疫苗是控制我国非洲猪瘟疫情 的迫切需求！目前， 通过基因缺失致弱成为非洲猪瘟
15、疫苗研究重要的方向。 0005 非洲猪瘟是由双链DNA 病毒，基因组较大， 基因型众多(24个基因型)Quembo ， C.J. ， etal. ， GeneticcharacterizationofAfricanswine fevervirusisolates fromsoftticksatthewildlife/domesticinterfaceinMozambiqueand identificationofa novelgenotype.TransboundEmerg Dis， 2018.65(2)： p.420 - 431. ，编码150- 167种蛋白，免疫逃逸机制复杂， 一般是由多
16、个毒力基因共同发挥作用，这 就导致不同基因型之间的生物学特性差异较大，不同基因型之间交叉免疫保护能力较差 Souto， R.， et al. ， VaccinePotentialof Two PreviouslyUncharacterizedAfrican SwineFeverVirusIsolatesfromSouthernAfricaand HeterologousCross Protectionofan AvirulentEuropean Isolate.TransboundEmerg Dis， 2016.63(2) ： p.224 - 31； King， K.， etal. ， ProtectionofEuropean domesticpigsfromvirulent Af r i can i s ol at esofAf r i can s wi nef ev erv i r usbyex per i ment al immunisation.Vaccine ，2011.29(28)：p. 4593- 600. 。 0006 在CN 106459931 A
