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1、第一节 核酸的分离纯化第二节 聚合酶链式反应（PCR） 第三节 凝胶电泳系统第四节 核酸的分子杂交第五节 核苷酸序列分析第六节 基因工程,第五章 分子生物学实验技术,分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。,DNA分子的切割与连接,核酸分子杂交,凝胶电泳,细胞转化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因操作,基因的定点突变,PCR扩增等,核心技术,基因工程诞生的基础,1、理论上的三大成就 2、技术上的二大发明,三大成就 ：,1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗
2、传的物质基础问题；,1928 Frederick Griffith 3）保持一定的离子强度; 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.,Home,（二）防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1 DNA酶抑制剂,1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； 2） 阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋
3、白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。,2 RNA酶（RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。
4、 4）剧毒。,（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),Home,二 分离提取核酸的主要步骤,（一）细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,Home,（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白
5、质分开，同时避免核酸降解。,常用方法： 1 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；,3 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或
6、黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,Home,（三）核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,1 核酸沉淀的盐类及浓度,2 有机沉淀剂,（1）乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。,（2）异丙醇,优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
7、 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,（3）聚乙二醇（PEG）,优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,3 核酸沉淀的温度和时间,一般
8、强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。,Home,(四）核酸的浓度测定,1 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD2
9、60不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1g / ml时，DNA钠盐的OD2600.02当OD2601时，dsDNA浓度约为50g / ml ssDNA浓度约为37g / ml RNA浓度约为40g / ml,原理： 核酸在260nm处有最大吸收峰 蛋白质在280nm处有最大吸收峰 盐和小分子在230nm处有最大吸收峰 OD260/OD2801.7 OD260/OD2302.0 1 OD260=50 g/mL DNA,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积 后，转入分光光度计的石英比色杯中。 b分光光度计先用一定量的水
10、校正零点。 c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d计算浓度。 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 50/1000； RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40/1000。 e分析纯度。,A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA
11、的DNA溶液比值为1.8的情况。,测定结果分析,B：测RNA 纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。,2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。 原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,Home,（五）核酸的保存,1 对DNA 保存： DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 2 对RNA 保存： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。,
