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1、生化实验技术 综合设计性大实验,合作性学习实验实施流程及要求,课堂理论学习：辅导相关生化大分子提取分离纯化基本知识 项目发布：了解项目内容 网上预约：理论自学设计实验方案网上递交教师修改及审核实验室项目实施论文上交教师批阅评分 实验分组：各自组合，最多不超过4人/组，推选组长，负责平时讨论、项目方案设计及材料收集,实验实施要求：平时按各组计划时间分别进行实验，组长有义务指导下组相关实验内容，每次实验必须登记。 全班交流：实验结束安排课堂讨论交流，每组准备一人汇报，一人记录；要求用PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难点，其他组学生质疑，教师点评。 指导教师：汪财生、斯越秀,通过综合训练，能够系
2、统掌握蛋白质、DNA制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析；在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。,实验项目训练目标,思考题（课前设疑）,1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？ 2.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？ 3.在制备生化物质前应如何选择原料？,4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？ 5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？ 6.以血清球蛋
3、白为例解释提取制备每步骤的基本原理？,7.干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转型？ 8.动植物总DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以猪脾脏DNA提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所提取DNA的纯度？ 9.蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量测定方法有哪些？,07级生物技术实验安排,11-14周 生物技术072-073班实验 14-16周 生物技术071班实验 15周 生物技术072-073班上交 论文及讨论材料等 17周 生物技术071班上交论文 及讨论材料等,第一部分,生化物质的制备分析,一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶
4、段：,1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎； 3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗 品的工艺过程； 4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、 层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行 精制的工艺过程；,利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题：,6.成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。,5.干燥及保存；,1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物
5、在分离时仍在不断的代谢变化中。,2在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有1l0 000，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比“虎头蛇尾”。近年来，用所谓“钓鱼法”，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的优越性。,3许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保护这些化合物生物的活性，常选择十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中，过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体内自身酶
6、的作用，均可破坏这些分子的结构或生理活性。,4生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、pH、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常无法固定，有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。因此，要建立重复性好的成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。,5生化制备方法最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对“均一性”结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。,原料选择和预处理,选什么样的原材料应视生产目的而定。一般
7、要注意以下几个方面:,1要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2来源丰富易得； 3制造工艺简单易行； 4成本比较低； 5经济效果要好。,如蛋白质原料的选择,蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。,对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。,1种属,牛胰含胰岛素（insulin)单位比猪胰高，牛为4000 IUkg胰脏，猪为3000 IUkg胰脏。抗原性则猪胰岛
8、素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。,2发育生长阶段,幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。,3生物状态,动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO（erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。,4原料来源,血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。,5原料解剖学部位,猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高
9、各产品的收率。,胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。,6.从简化提纯步骤着手,如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。,7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；,用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。,用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修
10、饰的缺陷；用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。,原料的粉碎,在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。,不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。 如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。,主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（10 000rmin
11、）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。,(一)机械法,(二)物理法,1.反复冻融法,把待破碎的样品冷至1520，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。,在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。,2.冷热交替法,3超声波处理法,多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50100mgL菌体的浓度，在1KHz10KHz（千赫兹）频率下处理1015min。
12、对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。,4.压破碎法,加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达20.5934.32MPa （210350kgfcm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。,(三)生化及化学法,1自溶法,即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料选在04，微生物材料则多在室温下进行。,自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造
13、具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。,2酶处理法,用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8的0.1molL三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.01molL乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保温10min，细菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶用于酵母细胞的破碎；用胰酶处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。,3.表面活性剂处理法,表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有
14、乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。,生化物质的提取,利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extraction），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固体态物质提取的过程可称为浸渍（maceration）；用热溶剂者可称为浸提（digestion），也称浸煮,一、物质的性质与提取,（一）物质的性质与提取方法的选择,选择合适的溶剂系统与提取条件。,（二）活性物质的保护措施,1采用缓冲系统 2添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等） 3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4其他保护措施(
15、避免过酸过碱和剧烈搅拌 ）,（三）生化物质的提取,一般生产上多用23次提取。溶剂用量（L）为生物材料的25倍，少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。,二、影响提取的因素,（）温度,（二）酸碱度,（三）盐浓度,三、提取方法,（一）用酸、碱、盐水溶液提取,（二）用表面活性剂提取,（三）有机溶剂提取,对酸性物质的提取，常在碱性条件下进行；对碱性物质的提取，常在酸性条件下进行；对两性物质的提取，则使水溶液的pH值在远离该两性物质的等电点为佳。,（三）超临界气体的萃取技术,以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有
16、液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。,气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。,该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。,四、提取液的分离,提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分离。溶液与固体的分离，一般处理方法有三种：自然沉降、过滤、离心。 自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等方法将液体部分移去。,过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程。 离心是
