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1、第三章病毒和亚病毒 病毒学（ virulogy）研究病毒（virus ）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生 物学的重要分支学科。 第一节病毒 一、病毒的发现和研究历史 第一个记载的植物病毒病当属郁金香碎色花病，至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆还保存着 一张 1619 年荷兰画家的一幅得病的郁金香静物画。 当时人们对郁金香病花的狂热了，一枚得病的郁金香球茎竟能换成吨的谷物或上千磅的 奶酪。 1886 年， A. Mayer 发现烟草花叶病具有传染性 1898 年， M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果： 能通过细菌滤器； 可被乙醇沉淀而不失去其感染性， 能在琼脂凝胶中扩散；
2、用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活； 结论：病原是一种比细菌还小的“有传染性的活的流质”。 真正发现病毒存在的是贝叶林克，给病毒起拉丁名叫“Virus”也是他。 一百多年以来， 烟草花叶病毒在病毒学发展史乃至遗传学、生物化学以及当代基因工程 中起到了里程碑的作用。 1917 年迪海莱（ F. DHerelle） 痢疾杆菌培养液（浑浊）+ 污水 培养液变清澈 细菌过滤器 清液 +痢疾杆菌培养液（浑浊） 培养液变清澈 引起细胞破裂的因子叫噬菌体 二、病毒的特点和定义 1. 特 点 1）不具有细胞结构，具有化学大分子的特征。 Eg. 一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coa
3、t ） 构成，故可把它们视为核蛋白分子。 1 / 10 朊病毒甚至仅由蛋白质构成 3）大部分病毒不能进行独立的代谢作用。 4）严格的活细胞内寄生，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。 5）个体微小，在电子显微镜下才能看见 6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。 7）在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持其侵染活力。 8）有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。 2. 定 义 什么是病毒？ 病毒（virus)是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其 本质是一种只含DNA或 RNA的遗传因子。 病毒是一类非细胞生物，故称之为
4、病毒粒或病毒体（virion） 病毒颗粒或病毒粒子（virus particle） ：专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个 病毒。 三、病毒的宿主范围 病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性 （二）病毒的形态 （三）典型病毒粒的构造 1. 病毒粒的结构 2. 病毒粒的对称体制 3. 病毒的群体形态 （1）包涵体（ inclusion body） 病毒粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，就形成了具有一定形态、构造并能用光学显 微镜加以观察和识别的特殊“群体”，称之为包涵体（inclusion body） 。 有的可用肉眼观察， Eg： 由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌斑（plaq
5、ue ） ； 由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑（plaque ） ； 由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑（lesion ，病斑）。 4. 噬菌体的形态 从结构上噬菌体可分为六个类群 类：有头有尾，尾部可收缩，双链DNA 2 / 10 类：有头有尾，尾部不可收缩，双链DNA 类：有头有尾，尾短不收缩，双链DNA 类：有头无尾，单链DNA 类：有头无尾，单链RNA 类：丝状，单链DNA 3. 复合对称的代表T偶数噬菌体 E.coli 的 T 偶数（ even type ）噬菌体共有3 种，即 T2、 T4 和 T6。 四、病毒的核酸 核酸是病毒的遗传物质； 一种病毒的毒粒只含有一种核酸：D
6、NA或是 RNA ； 五、 4 类病毒及其繁殖方式 病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组 和新的蛋白质， 然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly ）成子代毒粒， 并以一定方式 释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication） 。 （一）原核生物的病毒噬菌体 1. 噬菌体的繁殖 噬菌体的繁殖一般分为5 个阶段，即 吸附 侵入 增殖（复制与生物合成） 成熟（装配） 裂解（释放） 根据噬菌体与宿主的关系，噬菌体可以分为 烈性噬菌体： 凡在短时间内能连续完成以上5 个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性 噬菌体。 温和噬菌体：进入菌
7、体后并不进行增殖或引起溶菌。 烈性噬菌体所经历的繁殖过程，称为裂解性周期（lytic cycle）或增殖性周期 （productive cycle） 。 现以E. coli 的 T 偶数噬菌体为代表加以介绍 吸附（ adsorption） 吸附作用受许多内外因素的影响 3 / 10 1. 噬菌体的数量 由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此所能吸附噬菌体的数目也有一个限量。 每一敏感细胞所能吸附的相应噬菌体的数量，就称感染复数（m.o.i ，multiplicity of infection） 。 2. 阳离子 Ca2+、Mg2+ 和 Ba2+等阳离子对吸附有促进作用； Al3+、Fe3+和
8、 Cr3+等阳离子则可引起失活。 3. 辅助因子 生物素可促进产谷氨酸细菌噬菌体的吸附作用。 4.pH 值 在中性时有利于吸附， 在 pH 5 和 pH 10 时不易吸附。 5. 温度 在生长最适温度范围内最有利于吸附。 利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑制作用，在发酵工业中对防止噬菌体的污 染有一定的意义。 侵入 T4 通过尾丝吸附于宿主E.coli 表面。 吸附后， 由于基板受到构象上的刺激，中央孔开 口，释放溶菌酶并水解部分细胞壁，接着尾鞘蛋白收缩，把尾管插入宿主细胞中。 有尾噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞 通过尾部刺突固着于细胞； 尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，是细胞壁产生小孔；
9、 尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外； 如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞 立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为自外裂解（Lysis from without） 。 增殖 成熟（ maturation） 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配， 亦称成熟（maturation） T4 噬菌体的生命旅程 病毒的生活史： 严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。 4 / 10 2. 噬菌体效价的测定 在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、 边缘和透明度的负菌落称噬菌斑。可用作噬菌 体的鉴定指标，也可用于纯种分离
10、和计数。 效价（ titre titer） ：表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌 斑形成单位数（plaque-forming unit，pfu ）或感染中心数（infective centre） 。 测定效价的方法：双层平板法（two layer plating method） 双层平板法主要有以下几个优点： 加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补； 所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘 清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象； 因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。 3. 一步生长曲线（one
11、 step growth curve） 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作 一步生长曲线或一级生长曲线（one-stepgrowthcurve） 。 反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数 潜伏期（ latentphase） 裂解期（ risephase ） 裂解量（ burstsize） （1）潜伏期（ latentphase） 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配前的一段时间，故整段潜伏期 中没有一个成熟的噬菌体粒子从细胞中释放出来。 潜伏期又可分两段： 隐晦期（ eclipsephase） 指在潜伏期前期人为地（用氯仿）裂解细胞，裂解液仍无侵染性的一段时间。 胞内累积
12、期（intracellularaccumulationphase） 又称潜伏后期， 在隐晦期后， 如人为地裂解细胞， 其裂解液出现侵染性的一段时间。 这是噬菌体开始装配的时期，在电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。 （2）裂解期（ risephase ） 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。 （3）平稳期（ plateau ） 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点后的时期。 5 / 10 一步生长曲线的实验步骤 1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞； 2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）； 3、将上述混合物大量稀
13、释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞； 4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）； 5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线； 潜伏期： 不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或 天计。 裂解量： 噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万 个。 4. 溶源性（ lysogeny ） 温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，噬菌体DNA 整合到宿主的基因组上，并随宿主的复 制而进行同步复制，温和噬菌体侵入并不引起宿主细胞裂解的现象溶源性或溶源现象。 （1）溶源噬菌体（lyso
14、genicphage） 侵入细胞后， 噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制 而进行同步复制，一般情况下不进行增殖、不引起宿主细胞裂解的噬菌体，称温和噬菌体 （temperatephage ）或溶源噬菌体（lysogenicphage） 。 （2）前噬菌体（ prophage ） 当温和噬菌体侵入其宿主的细胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因组（genome，即 核染色体）上，这种处于整合态的噬菌体核酸，称作前噬菌体（prophage ） 。 （3）温和噬菌体的三种存在形式 游离态 指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子； 整合态 指已整合在宿主基因组上的前噬菌
15、体（prophage ）状态； 营养态 指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的 状态。 温和噬菌体的种类很多，常见的有E.coli的、 Mu-1、P1和 P2噬菌体等。 （4）溶源菌（ lysogen 或 lysogenic bacteria） 凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体，温和噬菌体的宿主就称溶源菌（lysogen或 6 / 10 lysogenic bacteria） 。溶源菌是一类能与温和噬菌体长期共存的宿主细胞。 （5）溶源菌的显著特性 溶原性是溶源菌的一个极稳定的遗传特性 自发裂解（ spontaneous lysis） 10 -2-10
16、-5 诱导（ induction）UV 温和噬菌体的溶源性反应： 烈性噬菌体（virulent phage） ： 感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lytic cycle） 。 温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage） ： 感染宿主细胞后不能完成复制循环， 噬菌体基因组 长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。 这一现象称做溶源性（lysogeny ）现象，在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合 于宿主染色体中（如噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。 溶源菌的识别 检验某菌株是否为溶源菌的方法，是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合，然后 与上层琼脂培养基混匀后倒平板，经培养后溶源菌就一一长成菌落。由于溶源菌在细胞分裂 过程中有极少数个体会引起自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌 菌苔，于是就形成了一个个中央有溶源菌的小菌落，四周有透明圈围着的这种独特噬菌斑。 （二）植物病毒 植物病毒大多为ssRNA病毒，基本形态为杆状、丝状和球状 （二十面体），一般无
