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1、免疫固定电泳操作规程 1 免疫固定电泳操作规程免疫固定电泳操作规程 一项目名称 免疫固定电泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION） 二检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三方法学原理 血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于-球蛋白和-球蛋白区域，通常疑为单克 隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是 一种简单的技术， 电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上， 通过下 列四个步骤： 1蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的 泳道上，并让固定剂和抗血清在
2、凝胶内渗透扩散。 3使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区 带进行比较。 为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP 作为参考 泳道以显示电泳后的蛋白质。 其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。 通过它 （们） 与抗血清， (IgG)、(IgA)、(IgM)重链和、轻链（游离和非游离）反应与否进行鉴别。该技术简 单、快速、图象清晰，易于解释结果。 四方法学溯源 自 1930 年由 Tiselius 发现了移界电泳（moving boundary eectrophor
3、esis） ，而后，这种技 术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持 介质的选择是电泳成败的关键。 通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋 白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。 五仪器 （一） 型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二） 分析和计算参数： 1 处理量：约 18 个样本/小时 2 所需样本量：10ul 3 检验时间：约 55 分钟 4 重复性：有良好的批内和批间重复性 5 电泳参数：电压 0300V（可选至 3000V） 电流 0500mA 功率 0100W 免
4、疫固定电泳操作规程 2 六试剂及配套品 （一） 试剂 1 HYDRAGEL 1 IF 试剂盒 HYDRAGEL 2 IF 试剂盒 HYDRAGEL 4 IF 试剂盒 HYDRAGEL 9 IF 试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：10 测试/20 测试/40 测试/90 测试 （3）货号：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN4309 2 脱色液 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：Pack for 10100ml （3） 货号：PN4540 （4） 成分：柠檬酸 3洗涤液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 1080ml （3）货号：PN
5、4541 （4）成分：叠氮钠 4稀释剂 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 15ml （3）货号：PN4587 （二） 配套品：IF 试剂抗体 （1） 商标：SEBIA (2 ) 包装规格：Pack for 51ml （3） PN4315 七操作步骤 开机，启动电泳仪。 将 1 只（用于 1，2IF） ，2 只（用于 4IF）或 3 只(用于 9IF)点样梳置于整表面，有数字 的一端向上，在 2 分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加 10ul 样品，然后齿梳向上把加样 梳放于湿盒内 5 分钟。 电泳/免疫固定泳道 孔号ELPGAMKL Hydrasys 1 IF123456
6、 Hydrasys 2/4 IF 1 或 3 号样本234567 2 或 4 号样本91011121314 Hydrasys 9 IF 1,4 或 7 号样本123456 2,5 或 8 号样本789101112 3,6 或 9 号样本131415161718 免疫固定电泳操作规程 3 选择相应的“IF”电泳程序， 从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快 速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下 1/3 处加 200ul 蒸馏水或去离子水， 将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿 出现气泡。 自然放下支架，从湿盒
7、中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，1、2IF 的点样梳置于支 架 6 号位，4IF 的 2 只点样梳则分别置于 3 号和 9 号，9IF 的 3 只点样梳则分别置于 2，6 号和 10 号，注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色 箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束， 进行免疫固定操作。 打开电泳盖， 将加样梳和缓 冲条丢弃，移走两支架，用湿纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要 求将动物血清抗体加入抗体加样条： Hydrasys 1 IF 用 6 6 孔抗体加样条:每孔加 8l8l
8、抗体 Hydrasys 2/4IF 用 1515 孔抗体加样条:2 2 人份每孔加 88l 抗体，4 4 人份每孔加 12l12l 抗体 Hydrasys 9 IF 用 1818 孔抗体加样条: 每孔加 8l8l 抗体 固定好抗体加样架,将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖，按“Start”键开始免疫固 定。 10 分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，提示“PAPER BLOTTING” ，移走抗体加样架， 弃 去抗体加样条， 放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶表面, 左手固定好滤纸， 右手手指用力的摩 擦滤纸表面，注意勿将滤纸移动，关闭电泳舱盖，按“Start”键开始凝胶表面多余抗体的 吸收。 3 分钟
9、后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，移去滤纸，关闭舱盖，按“Start” 键开始凝胶片的干燥。 6 分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，取出凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板， 将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查洗液瓶中是否有 400ml 洗液，染色液瓶 内是否有 300ml 染色液，脱色液瓶内是否有 1000ml 脱色液以及是否排空了废液瓶后，菜单 上选择染色指令，按“Start”键开始染色。 在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将烘干的 胶片取下。 八临床意义 对多发性骨髓瘤、Waldenstrom 巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤、轻链病、重链病等
10、研究有 重大意义。 1 正常人体内有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定电泳图谱可见均匀分布的 IgG/A/M 2. 在 IgG/A/M 及 Kappar、lammda 的泳道上发现浓集的条带即为病理性的。 九标本要求 取新鲜血清进行分析，根据临床实验室对各种试验所使用的操作程序进行血清样本的采 集，样本置于冰箱内（28）可保存一周，若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血 清样本加入 0.02g/dl 的叠氮钠可以增加其存放稳定性。 免疫固定电泳操作规程 4 为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如下稀释，并混匀。 特殊情况 当总免疫球蛋白的水平20g/L，稀释剂量加倍（除了 ELP 泳
11、道） 当总免疫球蛋白水平5g/L，稀释剂量减半（除了 ELP 泳道） 冷藏或冰冻后，某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）可能变得粘稠或混浊。这种样 本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下，加 25ul 液化剂于 75ml 血清中，混 匀 15 秒。然后按规定程序继续进行。 某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。 在这样 情况下（i）准备 1巯基乙醇（这种还原剂可在室温于未封闭微管内保存 1 周） （ii） 加 25ul 还原剂于 75ul 血清中（iii）混匀并令其反应至少 15 分钟（至多 3 小时）后按规定程 序继续进行。 避免使用血浆标本。 十. 操作注意事项 为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。 注意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。 泳道泳道血清血清(ul)稀释剂稀释剂(ul) 蛋白电泳 (ELP)和其他免疫球蛋白固定泳道3060 IgG 免疫固定泳道20100
