免疫胶体金标记手册-新修订

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1、浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖 浙江大学 2001 年 10 月 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 1 一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径 1500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在 3-30nm 范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始， 因此产生的胶体

2、金粒子数量越多， 但体积也越小。 粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的 1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 316nm 的胶体金。因 此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 0.10.2的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂， 可以制备12150 nm直径的胶体金。 但制备大体积的胶体金时， 胶体金粒子的误差也同时增加。 因此做单标记时， 建议使用该方法制备 12-16 nm 直径的胶 体

3、金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或 1g） ，因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（-20） 。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时， 烘干） 。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 m 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。

4、 制备好的胶体金保存寿命较长，可 4保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备 316 nm 胶体金 (1) 取一 250 ml 三角瓶，加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1氯化金，预热至 6070。 (2) 取一 50 ml 烧杯， 加入 4 ml 1柠檬酸钠， 然后根据所制备金粒子体积大小加入不 同用量的单宁酸及等量的 25 mM K2CO3。预热至 6070。K2CO3的作用是保持 溶液的中性 pH。因此如果单宁酸的量少于 0.5

5、 ml 时，对 pH 的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 2 柠檬酸钠（ml）单宁酸（l）胶体金（nm） 450003 420004 45006 41208 47010 41016 2、白磷还原法制备 5 nm 胶体金 (1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 79 ml 双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用 0.25 M K2CO3将 溶液调至中性（pH7.0） 。 (2) 取 0.2 ml 饱和磷/乙醚溶液加到 1.5 ml 试管中，再加 0.8 ml 乙醚，混匀。取 0.7 m

6、l 加入溶液 （1） 中(磷有毒且易燃， 操作请带手套， 多余的磷溶液用 CuSO4进行中和)。 (3) 室温下轻轻摇匀 15 min，然后加热沸腾并保持 5 min，自然冷却。 3、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973) (1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1%氯化金，加热沸腾； (2) 取不同量的 1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾 30 min，溶液颜色首 先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则 颜色偏向紫色。 注 意： (1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备

7、过程中的其它问题，胶体金粒子的大 小及一致性与理论值可能有偏差， 因此， 在制备完成后必须进行镜检。 如出现粒子体积偏差太大， 柠檬酸钠(ml)胶体金(nm) 512 416 324 2.830 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 3 粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。 (2)胶体金溶液最好保存在 4冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存 1-2 个月。但决不可保存 在 0以下，否则金粒子发生凝聚。 二、蛋白-金复合体的制备 一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒 子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。 金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋

8、白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来 电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋 白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小， 因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备 中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。 胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓 度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用 低浓度缓冲液中进行。 （2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或

9、高浓度蛋白溶液中蛋 白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定 量分析。 （3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD） ，形成的蛋白复合体往 往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知 蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA，牛血清蛋 白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。 当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不 确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同

10、 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的 适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际 情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。 在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。 如果在制备探针时加入太多的蛋白， 不仅造成浪费， 而且更为严重的是容易造成探针凝聚， 并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭” （Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记

11、位点希少、被标记物含量较少的情况 下要特别注意。 这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全 不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 4 因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。 1、抗血清的前处理 一般抗血清中 IgG 的含量为 10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探 针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在 实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致 IgG 活性的大幅降低。如果你的实 验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更

12、好。 大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步 骤如下： (1) 取抗血清 0.2 ml； (2) 加生理盐水（0.85 NaCl）0.3 ml，混匀； (3) 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4静置 1 h； (4) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀； (6) 逐滴加 0.25 ml 饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4静置 1 h； (7) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (8) 重复 58 步骤一次； (9) 加生理

13、盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀； (10)生理盐水中透析 1224 h； (11)在 0.2 M pH 9.0 硼酸缓冲液透析 1224 h； (12)分装，即将使用时 4保存，备用-20保存。 为最大限度保持抗体活性，整个过程应在 4下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生 理盐水透析改为 3 M KCNS 透析， 促使聚合的多聚体解聚。 如果抗血清效价较低时， 不宜准备胶体金探针。 2、亲和纯化抗体的处理 亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人 的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是 IgG 分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有 较多的盐分。因此

14、前处理的目的在于脱盐和解聚。 其基本步骤如下： (1) 将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为 0.5-1 mg/ml 浓度 (2) 在 3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析 12 h (3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸缓冲液中透析 12 h（更换透析液数次） (4) 分装备用 其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的 pH 值应与交联时 pH 值一致。 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 5 在实际运用中，一般省略去 3M KCNS 透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖 蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗 IgG，Protein A，Protein G，Streptav

15、idin）等时， 严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。 3、IgG Fab 片段的制备 一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时 有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的 蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。 IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L） 。用 水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc。其中 Fab 是具有抗原识别活 性的部分，回收后制备探针。Fc 能够与 Protein A 和 Protein G 特

16、异性结合。但这种分离只 能在有条件的实验室进行。 其基本过程如下： (1) 用 PBS（pH 7.0，含 10 mM EDTA，20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG (2) 加固化木瓜蛋白酶 (3) 37处理 5h (4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀） (5) 过 Protein G 柱 (6) 纯化的 Fab 片段按前文方法做进一步处理 注：Fab 与胶体金结合的 pH 值为 6.5 4、蛋白与胶体金结合最佳 pH 测定 (例纤维素酶，pI 未知) (1) 取若干个 1.5ml 试管，分别加入 1 ml 10 nm 胶体金； (2) 用 25 mM K2CO3将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10； (3) 取一 96 孔培养板，按 pH 从低到高分别将上述胶体金分别取 100 l 加入孔中，重 复三次； (4) 每孔分别加入 3 l 浓度为 1 mg/ml 的纤维素酶，混合，室温下放置 10-15 min； (5) 每孔分别加入 20 l 浓度为 10 NaCl 溶液，混合，室温下放置 10 min； (6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的