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1、叶绿素含量的测定1、 原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三
2、个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A663nm和A645nm为叶绿
3、素溶液在663nm和645nm处的吸光度，Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。 解方程（1） （2）组得 Ca=12.72 A6632.59 A645 (3) Cb=22.88 A6454.67 A663 (4) 将Ca+Cb相加即得叶绿素总量CT CT Ca十Cb20.29A6458.05 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或
4、单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： CT (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler等对Arnon进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： Ca12.21A6632.59 A646 (7) Cb=20.13 A6465.03A663 (8) Cx.c (9) 式中：Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度； Cx.c为类胡萝卜素的总浓度；A663 A646 A470 分别为叶绿素提取液在波长663nm 646nm 470nm下的吸光度。由于叶绿素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，
5、计算公式也有所不同。绿素a 、叶绿素b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式； Ca13.95A6656.8A649 (10) Cb=24.96 A6497.32A665 (11) Cx.c (12)2、 材料、仪器设备及试剂（一）材料 新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备 1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。（三）试剂1.96乙醇（或80丙酮）。2.石英砂。3.碳酸钙粉。三、实验步骤1. 取新鲜植物叶片（
6、或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置35min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、64
7、9nm下测定吸光度。四、实验结果计算与分析按公式 (10) 、 (11) 、 (12) （如用80%丙酮，按公式7、8、9）分别计算绿素a 、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度（mg/L）。(10) 、 (11)式相加即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后再按下式计算组织中个色素的含量（mg/L鲜质量或干质量表示）：叶绿素含量（mg/g）=式中：C为色素含量(mg/L);V为提取液体积 (mL)；N为稀释倍数；W为样品鲜质量或干质量(g)；1000即1L=1000ml。注意事项(1) 为了避免叶绿素光解，操作时应在弱光下进行，淹没时间应尽量短些。(2) 叶绿体色素提取液不能 浑浊。可在710nm或750nm下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时吸光之哦的5%，否则应重新过滤。(3) 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm,则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和叶绿素来校正（表2-12-1）表2-12-1叶绿素含量测定记载表材料处理重复样品质量提取液总量吸光度色素浓度mg/L组织中个色素含量mg/gCa/b仪器测定型号A646A649A470CaCbCTCxcCaCbCTCxc12312
