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1、质粒DNA的提取鉴定,掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。 掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。,一、实验目的,质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄生性的自主复制子。 细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。,二、实验原理,碱变性抽提法法是常用的
2、方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。 在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。,二、实验原理,抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在： 1. 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），
3、常以超螺旋形式存在； 2. 开环DNA（open circular DNA，ocDNA），此种质 粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子； 3. 线状DNA（linear DNA，lDNA），质粒DNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋DNA。 cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。,三、操作步骤 详见189-190页,50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2,200 mM NaOH 1% （W/V） S
4、DS,3 mM KAC,2,510 min,30 min 以上,不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为： 共价闭环DNA开环DNA线状DNA。 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。,四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理,1.琼脂糖凝胶的制备：本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液，置于微波炉使其充分融化。室
5、温放置至60左右，加入EB使其终浓度为0.5ug/ml，混匀，倒胶板（30ml/板）。 2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,3. 加样：20ul TE + 3ul 上样缓冲液，取6ul 进行点样 4. 电泳： 电压：60V 电泳时间：0.5 h 电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约1cm处 5.检测：取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒DNA只有超螺旋DNA一条带。 6.凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防EB污染。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,六、实验报告要求,一、 原理 二、 操作 三、 结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离） 四、 结果说明 五、 思考题 1、分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂? 2、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？,
