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1、实验五质粒DNA的提取鉴定,掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。 掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。,一、实验目的,质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄生性的自主复制子。 细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。,二、实验原理,碱变性抽提法法是
2、常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。 在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。,二、实验原理,抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在： 1. 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDN
3、A），常以超螺旋形式存在； 2. 开环DNA（open circular DNA，ocDNA），此种质 粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子； 3. 线状DNA（linear DNA，lDNA），质粒DNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋DNA。 cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。,三、操作步骤 1.取2ml细菌培养液于2ml Eppendorf离心管中，4，5000rpm，离心5min， 弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可
4、能流尽），保留菌体沉淀。 2.沉淀悬浮于100ul预冷的试剂（TEG缓冲液）中，混匀（置混合器振 荡），冰上置10min。 3.加入新配制的试剂（碱裂解液）200ul，加盖，轻轻颠倒34次，冰上置 10 min。 4.加入预冷的试剂（乙酸钾溶液）150ul，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置10 min 。12000rpm，4，离心10min，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。 5.上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，12000rpm， 4，离心10min。 6.取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇=24：1） 抽提，12000rpm，4，离心10min。
5、7.取上层水相置于另一离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后 置20过夜（至少要放置2h以上）。 8.12000rpm，4，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。 9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA）待用。,50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2,200 mM NaOH 1% （W/V） SDS,3 M Na
6、AC,省去,2,5 min,30 min 以上,实验步骤,不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为： 共价闭环DNA开环DNA线状DNA。 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。,四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理,1.琼脂糖凝胶的制备：本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液，置于微波炉使其充分融化。室温放置
7、至60左右，加入EB使其终浓度为0.5ug/ml，混匀，倒胶板（30ml/板）。 2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,3. 加样：10 ul TE 溶解+ 4 ul 上样缓冲液，取10 ul点样 4. 电泳： 电压：120V 电泳时间：45 min 电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约1cm处 5.检测：取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒DNA只有超螺旋DNA一条带。 6.凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防EB污染。,五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤,六、实验报告要求,一、 原理 二、 操作 三、 结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离） 四、 结果说明 五、 思考题 1、分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂? 2、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？,
