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1、1,色谱分析在药物分析中的运用,2005年1月,2,一、概述,色谱学已发展成为一个独立的学科 医药领域是色谱应用的重要领域之一 液相色谱目前在常规分析仪器中的排列,3,色谱学已发展成为一个独立的学科,色谱作为分离分析学科，已有近一个世纪的发展过程。进入20世纪以来，科学技术有了飞速发展，色谱学已发展成为一个独立学科，形成了薄层色谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、超临界流体色谱、亲合色谱、疏水色谱、毛细管电泳和电色谱等许多分支。 各种色谱仪与质谱，红外核磁等技术联用仪器已成为令人瞩目的高新技术产品。,4,医药领域是色谱应用的重要领域之一,在药物分析中，利用色谱分析方法显得更为重要，尤其是高效液相
2、色谱法（HPLC）是目前药物分析中最常用的分析手段。它主要用于复杂成分、混合物的分离，即可用来作药物的定性、定量及杂质检查。 由于高效液相色谱法分析样品的范围不受沸点、热稳定性、相对分子质量大小及有机物与无机物的限制，使其应用范围极广。 一般说来，只要能将样品制成溶液，就可分析。且分离速度快，灵敏度高，色谱柱可反复使用，可选择的流动相比气相色谱法多。流出组分不被破坏，且容易收集，可在室温下操作，绝大部分药物均可用高效液相色谱法来作。,5,液相色谱目前在常规分析仪器中的排列,在2000年版一、二部药典中，用高效液相色谱法测定的品种比1995年版药典成倍地增加，2005年版一、二部药典又增加几倍。
3、而高效液相色谱法在几种仪器分析方法中，其分析数量的排列为第二，因其分离效率高，又能准确地反映所测成分的真实含量。中国药典应用高效液相色谱法的情况，目前仅次于美国药典，而优于英国药典和日本药局方。,6,二、共同探讨高效液相色谱在实际操作中的部分问题,高效液相色谱方法的建立 色谱分离类型的选择 溶剂的选择 溶剂纯化 溶剂的脱气 样品溶剂的选择 检测器的选择 系统适应性试验 无参比标准的纯度评价 HPLC在药物分析中的应用范围,7,高效液相色谱方法的建立,应用HPLC对样品进行分离、分析，主要根据样品的性质，选择合适的分离类型及所用的色谱柱和流动相、检测器等。 （一）样品的性质 样品中待测组分的分子
4、量大小、化学结构、溶解性等化学、物理性质决定着色谱分离类型的选择。,8,色谱分离类型的选择,高效液相色谱的各种方法有其各自的特点和应用范围，应根据分离分析的目的，样品的性质和含量、现有的设备条件等选择合适的方法。通常分离类型应根据样品的性质（如相对分子质量的大小，化学结构，溶解性及极性等）来选择，并根据此条件选择色谱柱和流动相。,9,溶剂的选择,在高效液相色谱分析中，流动相的种类、配比，对色谱分离效果影响很大，可供选择的固定相填料种类较少。因此，流动相的选择显得自关重要。 （1）溶剂纯度要高 （2）不能引起柱效损失或保留特性变化 （3）常用固定相与流动相的选择 （4）溶剂系统的选择常用 （5）
5、缓冲系统及缓冲溶液的处理,10,溶剂纯化,在HPLC分离测定中，溶剂的纯度是很关键的。溶剂足够纯才不至于产生问题，对溶剂纯度的要求依应用情况而定。,11,溶剂的脱气,液相色谱仪的检测器常被溶剂中的气泡干扰，气泡的形成是由于被空气饱和的溶剂从高压流向低压，如柱出口，这些气泡形成干扰检测器光学道路的折射表面。因此，限制气泡和伴随的噪音的常用办法是在用前从溶剂中除去气泡。常用的脱气方法有真空泵脱气法和煮沸脱气法。 1真空泵脱气 2煮沸脱气法 3溶剂的滤过,12,样品溶剂的选择,样品的溶剂应对样品溶解性大，且对样品稳定并与检测器相匹配，最好与流动相相同，这样可允许大量的进样量，但待测物的洗脱不应受影响
6、，当样品溶剂与流动相不同时，则会出现样品溶剂的峰。,13,14,缓冲溶剂的注意事项,色谱柱使用的流动相pH值范围为2.57.5为宜。酸性太强会使键合的烷基脱落，碱性太强会使硅胶溶解，通常用缓冲液维持一定的pH值。缓冲液浓度范围为0.0050.5mol/L，尽量用稀溶液为好，在用水和有机溶剂系统中，应注意盐的存在会改变溶剂的可混合性，在色谱分离过程中，绝不能发生相的分离和盐的沉淀。在HPLC中，最常用的缓冲溶液是醋酸盐和磷酸盐缓冲液。,15,检测器的选择,HPLC检测中，当样品有紫外吸收时，常选用紫外检测器，在药物分析文献中，用紫外检测器的占95%以上，使用时要注意溶剂的使用波长，即溶剂的极限波
7、长必须低于检测波长。若使用荧光检测器或电化学检测器，可使灵敏度提高23个数量级，但不是所有化合物都有荧光，无荧光的物质可经衍生化作用形成荧光的化合物。电化学检测适用于有氧化还原性的药物。,16,系统适应性试验,当选用HPLC方法后，不同操作者各实验室之间实验数据的重现性应引起注意。在HPLC中，很难实现很好的重现性，因有许多具有相同名称的填料，由于生产厂家不同，性质也不尽相同。有许多HPLC填料或柱随着使用而变坏，其原因是填料的水解或柱死体积因填料溶解而增加，因此面临着色谱柱是否与建立方法时的柱效相同的问题。 当用HPLC方法时，系统要有合适的性能，系统性能受所用的色谱柱和溶剂的影响，通常用分
8、离度，理论板数和峰拖尾因子等几个基本参数来测定系统性能。,17,峰形状是用于控制系统适用性的另一色谱参数，监测峰形的重要方法之一是测定理论板数，但因用峰宽或半峰宽的计算不能表示峰是否拖尾，所以用于测量理论板数的方法并不标准，而在系统适用性试验中，峰拖尾程度可以作为衡量柱效的另一指标，峰拖尾程度用拖尾因子表示。拖尾因子（T）定义为： 式中W0.05h为0.05倍峰高处的峰宽；d1为峰的前沿到峰出现极大值时的水平距离，如图。,18,中国药典2000年版和usp(24) 均规定在峰高5%处测定峰宽。 由于噪音及其他因素影响基线的 稳定性峰高5%处的峰宽值易受 其影响，从而干扰测定结果，有 人在峰高1
9、0%处测定，重现性较 好。峰拖尾程度对柱死体积和柱填料的变化很敏感，因此可作为衡量柱能否再用的标准。总之，柱性能是否处于良好水平，可使用关键的参数（如校正线的斜率，理论板数和峰拖尾程度来衡量。当这些参数超过允许范围时，就不应再用此柱进行实验。,19,无参比标准的纯度评价,HPLC已成为鉴定药物纯度的主要工具，用于鉴别和检查样品中的杂质，首先要求分离完全，为此要选择合适的色谱条件将杂质、降解产物与主分分离，评价杂质的主要问题是杂质的定量，可在相同的色谱条件下将杂质的峰面积与已知浓度的对照品的峰面积进行比较，但通常杂质是未知的，因此为测定样品中未知杂质的浓度，就需要做一些假设。,20,HPLC在药
10、物分析中的应用范围,HPLC法在药物分析中常用于药物的鉴别和检查 1、利用已知物对照法定性 2、色谱法与其他方法结合定性 （1）利用化学反应定性 （2）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外吸收光谱。 （3）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行IR.MS和NMR鉴别。 （4）液-质联用仪 3、定性分析,21,定性分析,1、利用已知物对照法定性 2、利用保留特性 3、色谱法与其他方法结合定性 （1）利用化学反应定性 （2）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外吸收光谱。 （3）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行IR.MS和NMR鉴别。 （4）液-质联用仪,22,定量分析,1、校正因子 2、定量
11、分析方法的种类 （1）峰面积归一化法 （2）外标法 （3）内标法,23,三、微柱色谱实用性进展,微柱液相色谱法与普通液相色谱法的比较 微柱液相色谱的应用范围,24,微柱液相色谱法的实用性进展,微柱液相色谱法与普通液相色谱的比较 分类 应用 快速药物分析 在药物分析中，复方制剂分析和治疗药物监测非常适合用微柱，进行快速分析。分析APC片中的3种主药，用100mm1mm微柱，填充3m的ODS，用乙腈-5mmol/L辛基磺酸钠溶液（18:20）为流动相，20s内分离即完毕，50个样品15min内即完成。流动相只需14ml，为常规柱的1/21。,25,微柱液相色谱法的实用性进展,微柱液相色谱法与普通液相色谱的比较 分类 应用 快速药物分析 在药物分析中，复方制剂分析和治疗药物监测非常适合用微柱，进行快速分析。分析APC片中的3种主药，用100mm1mm微柱，填充3m的ODS，用乙腈-5mmol/L辛基磺酸钠溶液（18:20）为流动相，20s内分离即完毕，50个样品15min内即完成。流动相只需14ml，为常规柱的1/21。,26,谢谢,
