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1、第七章 植物基因工程的基础知识与技术,李 英 (南京农业大学园艺学院) Tel:025-84395756 生科楼B6018 E-mail: 15050529159,课程主要内容,第一章 绪论 第二章 园艺植物组织培养的理论基础与基本技术 第三章 园艺植物脱毒与离体快速繁殖 第四章 园艺植物种质离体保存与无性变异系筛选 第五章 园艺植物的细胞工程 第六章 园艺植物的染色体工程 第七章 植物基因工程的基础知识与技术 第八章 园艺植物基因的分离与克隆 第九章 园艺植物遗传转化载体的构建 第十章 园艺植物遗传转化 第十一章 转基因技术在园艺植物育种的应用 第十二章 园艺植物的分子标记 第十三章 园艺植
2、物生物信息学 第十四章 园艺植物生物技术的安全性评价与管理 授课教师:李英,王建军,侯喜林,基因工程是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的系列操作技术总称。,外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,第七章 植物基因工程的基础知识与技术 第一节 植物遗传物质的基础知识 第二节 植物基因工程常用的工具酶 第三节 植物基因工程常用的载体 第四节 植物基因工程的基本技术,第一节 植物遗传物质的基础知识,核酸：是以核苷酸为基本
3、单位组成的生物大分子。DNA, RNA 核苷酸: 碱基，戊糖，磷酸 A,T,G,C; A,U,G,C -D-2脱氧核糖,遗传物质？,第一节 植物遗传物质的基础知识,DNA的结构与功能 RNA的结构与功能 蛋白质的结构与功能 遗传信息的传递 基因的概念,一、DNA的结构与功能,？ DNA的一级结构 指DNA分子中脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过磷酸二脂键连接形成的多核苷酸。又称碱基顺序。 DNA的二级结构 即双螺旋结构。 DNA的三级结构 DNA双螺旋进一步扭结、折叠形成的更加复杂的结构称为DNA三级结构，这种双螺旋结构可再次螺旋形成超螺旋结构。,生物的遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中，生物
4、界物种的多样性就在于DNA分子4种核苷酸千变万化。,DNA Model,DNA右手双螺旋结构是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构，但并不是不变的，当改变溶液的离子强度或相对湿度时， DNA结构会发生改变。,DNA超螺旋结构,DNA超螺旋结构的存在可能有两方面的生物学意义，一方面， DNA双链经过盘绕压缩使松弛性DNA更为紧密，体积更小，更能保持稳定。另一方面，影响DNA双螺旋的解链过程，从而影响与其他大分子如蛋白质、酶的结合。,二、 RNA的结构与功能,mRNA mRNA存在于细胞质中，直接指导蛋白质的合成。 tRNA tRNA是细胞内分子质量最小的一类核酸，由70120核苷酸构成。
5、 rRNA 是最多的一类RNA，也是3类RNA中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。,三、蛋白质的结构与功能,蛋白质的一级结构 由氨基酸通过肽键连接成一条多肽链，由一个氨基酸的羟基和另一个氨基酸的氨基进行缩合反应产生。 蛋白质的二级结构 指多肽采取的不同构象。两种主要形式是螺旋和折叠，二者都由多肽的不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。 蛋白质的三级结构 指将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。主要被氢键、
6、二硫键和疏水作用所稳定。 蛋白质的四级结构 即两条或更多已形成三级结构的多肽键组合在一起形成一个多亚基蛋白。不是所有蛋白都有四级结构。,定义： 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,1.蛋白质的一级结构,主要化学键：肽键 二硫键的位置属于一级结构研究范畴。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构,30,21,2.蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,定义：,稳定因素： 氢键,（一）肽单元 (peptide unit),参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽
7、键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。,肽单元,H,H,H,H,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（二） -螺旋,结构要点: 多肽链主链围绕中心轴形成 右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。 每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。 每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。,（三）-折叠,多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。 两段以上的 -折叠结构平行排列 ，两链间可顺向平行，也可
8、反向平行 。 两链间的肽键之间形成氢键，以稳固 -折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,（四）-转角和无规卷曲,-转角：,无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。, 肽链内形成180回折。 含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。 第二个氨基酸残基常为Pro。,-转角：,（五）模体,蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。,螺旋环螺旋,锌指,3.蛋白质的三级结构,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。,稳定因素：,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定
9、义,肌红蛋白 (Mb),纤连蛋白分子的结构域,结构域 (domain),大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。,结构域,Triose phosphate isomerase,亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。,4.蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚基 (subunit)。,血红蛋白（Hb）的四级结构,（1.）一级结构是空间构象的基础,蛋白质结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠
10、状态，无活性,（2）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,肌红蛋白与血红蛋白的结构,（3.）蛋白质空间结构与功能的关系,（4.）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion prote
11、in, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,1. DNA双螺旋结构发现 （Watson Crick,1953）,四、遗传信息的传递,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962,Central Dogma,2.中心法则提出（Crick，1958）,Crick,1916-2004,反转录机制阐明（ Temin 1970 ）,补充的中心法则,五、基因的概念,三大成就 40年代确定
12、了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,现在人们认为，基因是实体，它的物质基础是DNA或RNA，基因是具有一定遗传效应的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遗传信息传递和性状分化、发育的依据，基因是可分的。根据基因的产物可将其分为结构基因、调节基因、无翻译产物基因。简而言之，基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传物质的最小功能单位。
13、,第二节 植物基因工程常用的工具酶,限制性内切核酸酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 其他工具酶,常用工具酶及其功能,一、限制性内切核酸酶,限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 型限制性内切酶 型限制性内切酶 型限制性内切酶,定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。,限制性内切酶的命名举例,型限制酶的作用性质,1、基本特性： （1）识别位点为48个核苷酸序列； （2）识别位点即为
14、切割位点； （3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即呈回文结构。,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,切割方式通常有三种：,在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成齐平末端。如Hae， PvuII。 在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5端切断磷酸二酯键，形成5磷酰基端2-5个核苷酸单链粘性末端。如EcoR。 在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3端切断磷酸二酯键，形成3羟基端25个核苷酸单链粘性末端。如Pst。,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C
15、-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5
16、,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,二、DNA连接酶 （一） DNA连接酶和T4DNA连接酶 DNA连接酶 1976年发现，广泛存在于细胞内。目前应用的多数来自于大肠杆菌，称为E.coliDNA连接酶。分子量74000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上具有5-磷酰基和3-羟基的缺口，形成磷酸二酯键。,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,（T4DNA连接酶）,T4DNA连接酶 T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，
