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1、2020/10/17,1,第二章 DNA重组技术,2020/10/17,2,主要内容,DNA的结构 天然 DNA的制备 限制性核酸内切酶对DNA的切割. PCR扩增特定DNA片段 凝胶电泳检测DNA DNA片段的连接重组,2020/10/17,3,第一节 DNA的结构,一、DNA组成 Nucleic acid is polynucleotide, Nucleotides are the building blocks of Nucleic Acid DNA.,首,尾,2020/10/17,4,Pentosefive-carbon sugar,2-Deoxyribose 2脱氧核糖,1、核苷酸,
2、Phosphate、pentose、base(碱基),Hydrogen 氢,2020/10/17,5,Thymine胸腺嘧啶 T,Cytosine 胞嘧啶 C,Guanine鸟嘌呤 G,Adenine 腺嘌呤 A,Four Bases in DNA,Pyrimidines 嘧啶,Purines 嘌呤,2020/10/17,6,H2O,碱基,五碳糖,核苷键,核苷,602,2020/10/17,7,H2O,H2O,base,Phosphate,Pentose,核苷键,Phosphate ester bond,核苷酸 Nucleotide,Glycosidic bond,2020/10/17,8,8
3、种核苷酸,M-单(D-二。T三） ；P-磷酸 RNA的名称为某（单、二、三）苷酸， DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。 如AMP称腺苷磷酸(或腺苷酸）， dAMP称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。 稀有核苷酸与上类似；,2020/10/17,9,2、DNA,DNA 中核苷酸通过 3,5- 磷酸二脂键连接,2020/10/17,10,2020/10/17,11,二、DNA structure,2020/10/17,12,1、B型DNA双螺旋,Most DNA have double helix structure,(1). 两条链反向、平行、右手螺旋,有大沟和小沟,2020/10/17,13,
4、(2).磷酸、戊糖在外侧，碱基在内，链间碱基形成氢键。,2020/10/17,14,（3）.两碱基对间距 0.34nm, 螺距 3.4nm.,2020/10/17,15,经常用碱基对数来表示DNA长度,(4).碱基互补配对原则：A=T C=G,2020/10/17,16,2、DNA序列,在DNA中，两链间的碱基是互补的 知道其中一条链的序列后，另一链也可推测出来。 因此DNA序列一般只用其中一链序列由5向3书写,5 TCTC 3 3 AGAG 5,5 TCTC 3,2020/10/17,17,3、 DNA 变性,DNA变性：DNA双链打开变异无规则的单链的过程。 粘度下降，沉降速度增加，浮力上
5、升，紫外吸收增加. 变性因素 ：加热, 改变 溶液pH 、加有机试剂,2020/10/17,18,。,计算公式： （G+C)%=(Tm-63.0) 2.44,解链温度（Tm） 使50% DNA 变性的温度. 经常在 70-85 C 间，随G/C含量的升高而升高.,2020/10/17,19,4、DNA复性,变性因素去除后，变性DNA又恢复成双螺旋结构的过程。 温度下降过快，DNA不能复性。,变性,复性,2020/10/17,20,5 分子杂交,具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链过程叫核酸分子杂交,只要有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。,2020/1
6、0/17,21,DNA与DNA间的杂交,全部互补时,部分互补时,变性,复性,2020/10/17,22,DNA与RNA间的杂交,全部互补时,部分互补时,变性,复性,2020/10/17,23,6 DNA的形状,线性DNA： 真核生物的染色体 部分原核生物染色体 部分病毒,2020/10/17,24,环状 真核生物线粒体 叶绿体 部分原核生物染色体 质粒 部分病毒,2020/10/17,25,The circular DNA can be supercoiled 环状DNA以超螺旋形式存在,环状 DNA,2020/10/17,26,。,2020/10/17,27,负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向
7、与DNA双螺旋方向相反，旋转结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。 正超螺旋：与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，有紧旋效应。,2020/10/17,28,7 DNA 的复制,半保留复制（原核、真核） Semiconservation replication,2020/10/17,29,亲代DNA分子,第一子代分子,亲代DNA分子,第一子代分子,2020/10/17,30,DNA 复制过程 复制起始位点双链打开 引物酶合成RNA引物， DNA聚合酶延长引物. 前导链连续延伸, 滞后链通过
8、冈奇片段以不连续方式延伸。 在新合成的DNA链中将RNA引物剪去，以DNA替代 通过DNA连接酶将切口封闭。,2020/10/17,31,复制泡: 细菌、病毒、线粒体：单复制子 真核：多个复制子，双向等速复制,2020/10/17,32,2020/10/17,33,8 DNA 的转录,转录的过程：起始（启动子），延长，终止 转录后的加工：剪切，拼接及修饰.,2020/10/17,34,(1) 启动子： DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列,In promoter regions, there is a 10 region which sequence is “TATAAT”
9、 and is called “pribnow box” or “TATA box”. There is a 35 region which sequence is “TTGACA”. The sequences of the two regions are very conservative.,2020/10/17,35,promoter 基因编码区 5- |-35|-|10|-A-AUG-UGA -|T|-3 TTGACA TATAAT AGGAGG,Start site +1,转录区,termination sequence,-35 region,-10 region,SD 序列,ini
10、tiation codon,stop coden,2020/10/17,36,(2) 转录区,promoter 基因编码区 5- -|-35|-|10|-A-AUG-UGA -|T|-3 TTGACA TATAAT AGGAGG,Start site +1,转录区,termination sequence,-35 region,-10 region,SD 序列,initiation codon,stop coden,2020/10/17,37,转录起始位点（起录点）: 转录在特定的位点开始,经常发生在 A上. SD序列 在起录点下游有：AGGAGG序列，对应的mRNA序列也是AGGAGG，可与
11、核糖体中的 rRNA 序列TCCTCC互补结合，起始翻译。,2020/10/17,38,基因编码区: 从起始密码子到终止密码子间，含有遗传信息的的DNA序列。 原核生物一个启动子和一个终止子间有多个基因编码区，每个基因编码区均有各自的起始密码子和终止密码子。 真核生物只有一个基因编码区。,promoter 基因编码区 基因编码区 5-|-35|-|10|-A-AUG-UGA-AUG-UGA-|T|-3 TTGACA TATAAT AGGAGG,Start site +1,Transcription region,termination sequence,-35 region,-10 regio
12、n,SD 序列,initiation code,stop code,间隔区,2020/10/17,39,终止子：termination sequence DNA模板上的终止信号是由于DNA特殊的结构而起作用， 此处DNA多存在着反向重复顺序。 此区域容易形成发夹形结构，有助于转录的终止。,2020/10/17,40,RNA polymerase 中的 亚基 识别启动子区，并使RNA聚合酶结合. DNA在起始位点解旋成单链 RNA polymerase 开始转录. 亚基脱离，RNA开始延长. RNA延长并从DNA中脱离 在终止子处终止.,（3） 转录的过程,2020/10/17,41,2020/
13、10/17,42,转录后的RNA加工,真核生物RNA转录的初级产物需经过”加帽“”加尾”“剪切”“拼接”等一系列变化才能生成具有生物活性的RNA分子。这一过程称为转录后的RNA加工(RNA processing)。,2020/10/17,43,2020/10/17,44,8 翻译,以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则（三联体密码）合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质称为翻译。,2020/10/17,45,一、天然 DNA的来源与用途 来源：从不同生物的不同部位分离 染色体DNA (Chromosome DNA) 病毒DNA (Virus DNA) 质粒DNA (Pla
14、smid DNA) 线粒体DNA (Mitochondria DNA) 叶绿体DNA (Chloroplast DNA),第二节 天然 DNA的提取,2020/10/17,46,染色体DNA,特征: 巨大, 含有大量遗传信息( genetic information). 用途: 分离目的基因和基因表达调控因子,2020/10/17,47,Virus DNA,可在宿主细胞内复制,可体外包装. 可用作转基因载体或分离目的基因.,2020/10/17,48,环状，游离与细胞质中，可自我复制。1几百kb 主要用作基因克隆载体，也可分离目的基因。,质粒DNA Plasmid DNA,2020/10/17
15、,49,真核生物(eukaryote)有, 基因与呼吸作用和光合作用相关. 用途: 分离目的基因或作载体.,线粒体DNA 和 叶绿体 DNA,真核生物(eukaryote)有, 基因与呼吸作用和光合作用相关. 用途: 分离目的基因或作载体.,线粒体DNA 和 叶绿体 DNA,2020/10/17,50,二、天然 DNA的提取,2020/10/17,51,1、 准备生物材料,1、 准备生物材料,选用DNA最易提取，含量最多的组织。 大肠杆菌培养至对数生长后期。 植物选用幼嫩植株，暗培养1-2天或黄化苗。,2020/10/17,52,方法: 细菌(Bacteria)： 用溶菌酶(lysozyme)处理, NaOH和SDS处理 超声波(ultrasonic)处理 动植物: 粉碎、捣碎、研磨,2、裂解细胞 - Key step of DNA extraction,2020/10/17,53,提取总DNA(Extraction of total DNA) ：裂解液中加酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，分除蛋白质，在含DNA水相
