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1、第六章 色谱分离,内容简介,色谱概念及分类 色谱理论-热力学及动力学 各种色谱原理及操作 凝胶过滤 离子交换 疏水相互作用色谱 色谱聚焦及其它,1.1定义 色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。,第一节色谱概念及分类,在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动速度小。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。,色谱现象,In 1903，俄国植物学家Michael Tsweetts Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384). Chromatography = (c
2、hromatus = color, graphein = to write).,1.2 色谱法的特点,分离效率高 可选操作参数多 应用范围广 高灵敏度的在线检测快速 分离与过程自动化操作,色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡,1.3 色谱一般过程,组件及过程： A色谱柱(column)： B固定相(stationary phase)： C流动相(flow phase)： D洗脱液(elution)： E检测器(detector)： F部分收集器(portion c
3、ollector),柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。,1.4 色谱分类,1)、按应用的目的 A、制备性色谱(preparation Chromatography)：工业规模，实验室规模 B、分析性色谱(analytical Chromatography)：GC、LC、HPLC、TLC等。 2)、按流动相 A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相) B 、LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上) 3
4、)、按固定相 A、柱色谱法 B、毛细管色谱法 C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱,4）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,色谱分类,5)、按展开程序 A)、洗脱法 B)、顶替法 C)、迎头法 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。 迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的（分配系数最小）的组分能以纯粹的状态得到 顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：顶替展开所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质称为顶替剂（displac
5、er）。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。,6）根据流动方式进行分类 一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，沿轴向流向另一端，属于轴向流色谱（axis flow chromatography） 。 径向流色谱（radial flow chromatography）是在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。 连续环状色谱（continuous annular chromatography）。 拟移动床色谱（simulated moving bed c
6、hromatography）。,5）层析柱材料,耐压性 金属有机玻璃柱玻璃柱 耐酸碱性 有机玻璃柱好，玻璃柱不耐强碱，金属不耐酸碱 对生物样品的惰性 玻璃柱有活性位点，往往对蛋白产生吸附 观察特性 塑料，金属都不透明不利于观察，有机玻璃好,8）根据压力分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,操作压力在0.5MPa-5MPa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,第二节色谱理论,平衡模型（热力学-连续） 塔板理论（热力学-间歇） 速率理论（动力学）,2.1平衡模型,Wilson等人提出的平衡色谱理论的三个基本假设： 溶质在流动相和固定相之间的分配平衡在整个色谱
7、过程中都能瞬间实现； 传质阻力，纵向扩散对平衡的影响可以忽略； 溶质在色谱柱迁移过程中，在一定时间内，色谱柱每一小段溶质量的变化符合物料平衡原理。,根据物料平衡： 溶质在两相间的分配或吸附平衡常数：,通过数学处理，组分的保留值为：,从平衡色谱理论导出的溶质谱带迁移速率方程及相应的保留时间、保留体积表达式，初步揭示了物质在色谱柱的差速迁移过程。非线性等温线比较好地解释了不对称色谱峰，特别是拖尾峰的成因。但它未能阐明色谱流出曲线，实际应用比较有限。,根据平衡色谱理论，当分布等温线呈线性时，溶质的K为常数，谱带迁移速率不变，不产生色谱谱带扩张。若分布等温线为非线性，则K随Cm变化溶质迁移速度亦变化，
8、引起色谱峰扩张，形成不对称色谱峰。,平衡模型解释某些色谱现象,拖尾现象,优惠吸附中：,洗脱时间短,吐舌现象,非优惠吸附中：,洗脱时间长,K减少,K增加,2.2 塔板理论,塔板理论Plate Theory就是把分配色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，挥发度大的组分最先从“塔顶”（即柱出口）逸出，由于流动相连续地进入柱内，为了便于研究组分在两相间的分配行为。,塔板理论的基本假设,柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它在柱内又是不存在的，故称理论塔板。 每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，另一部分空间为流动相所占据。这后
9、一部分空间称为塔板体积（Vm）。流动相从柱入口以一个个Vm 体积，脉冲式地加入。 组分在每块塔板上的两相间瞬时达到平衡。 分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓度无关即相当于线性等温线的情况。 忽略塔板间的纵向分子扩散。,分离过程如下图所示,由表中可见，当n=5时，即5个塔板体积的流动相进入柱中时，组分就开始从柱口流出。并且呈现先小后大的情况。,以上是当塔板数为5时的情况，出现的峰形不对称 ，这是由于塔板数太少的原因。当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（约为106 109 ）。所以色谱峰一般为正态分布。,流出曲线 经N次平衡后，流动相中的组分分数q与在固定相组分分数p
10、符合二项式分布： （p+q）N 上例中K=1，p=q=1/2，展开为： （p+q）4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4 =1/16+1/4+3/8+1/4+1/16 若K=2，p=0.667，q=0.333，则 （p+q）4=0.198+0.395+0.296+0.099+0.012 当N50时，流出曲线对称呈正态分布。,二项式分布展开成高斯分布，得到色谱流出曲线方程：,当v=VR 最大组分浓度峰高：,W,决定色谱峰最大浓度的因素： l进样量(W)越大，峰高越大 l相同保留时间(VR)，塔板数(N)越大，峰高越大 l固定进样量和塔板数，保留时间越小，峰高越大，即色谱峰高且窄；反之，保
11、留时间长的组分色谱峰低且宽。,展开式可变形为：,决定色谱峰的区域宽度 的因素： 保留值越大，峰宽越大 塔板数越大，峰宽越小 柱长(L)越大，峰宽越大(增加VR) 峰宽与柱结构有关 塔板高度的计算公式 H = L / N Martin引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标！,2.3 速率理论 Rate Theory,塔板理论满意地解释了色谱流出曲线呈高斯分布；论证了组分的保留值与分配系数间的关系；并能成功地用于塔板数的计算。 塔板理论的缺陷： 在气相色谱中，忽略分子轴向扩散 流动相的运动是跳跃式的、不连续的假设显然违背了实际色谱过程 实际色谱过程难于达到真正的平衡状态 分配系数与浓度无关只在一定的范
12、围内成立,速率理论,1956年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)提出了色谱过程动力学理论速率理论。速率理论认为色谱分离是一个连续的流动过程，每个组分以一定的速率通过色谱柱，体系没有达到平衡，这是一种“非平衡过程研究方法”或“速率”模型。 速率理论能有效解释影响色谱峰展宽的各种因素，并把各种色谱参数与塔板高度定量地关联起来。,（1）涡流扩散(eddy diffusion) 也称为多径扩散,涡流扩散 原因：柱填充不均匀 A=2dp,A：涡流扩散系数，其单位为cm。 ：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形状决定。 dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径， dp小， A小；但dp 太小， 和
13、柱阻大。,（2）纵向扩散(longitudinal diffusion),原因： 浓度差,纵向扩散项 B/u 影响因素：u ， B=2Dm,B：纵向扩散系数，其单位为cm2/s， ：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散 的阻碍。 Dm：组分在流动相中的扩散系数。,（3)传质阻力(mass transfer resistance),传质：溶解、扩散、转移的过程。 传质阻力：影响传质过程的阻力。 传质阻力系数C，其单位s,A 固定相传质阻力,在固定相传质过程中，溶质分子必须越过流动相与固定相的界面，才能进入或离开固定相。 对于液体固定相进出的速度由扩散效应决定；对于吸附过程, 则取决于吸附-解吸的动
14、力学。 在固定相停留的时间和路径的长短，会影响谱带展宽的程度。, 液膜厚度(df)：减少液膜厚度, 可缩短组分在固定液内的扩散时间, 有利于平衡的迅速建立, 有助于提高柱效。 DS：具有较大DS值的固定液(一般粘度低）, 适当提高柱温（增加扩散系数）, 可缩短达到平衡的时间, 缓和谱带超前和滞后的程度。 u: 流速越大, 加大了固定相的传质阻力项。,B 流动相传质阻力,C固定流动相传质阻力,固定流动相,停滞流动相传质：当使用多孔固定相时, 除颗粒间的流动相外, 还有一部分存在于颗粒内部空隙中的流动相停滞流动相。溶质分子进入固定相既是通过扩散进入这部分停滞的流动相内。 HsM = kdp2u /
15、 (1k)2DS 这里是由固定相的性质及构型的差别引起的。要减少流动相传质阻力, 必须设法缩小固定相颗粒内的空隙深度, 或采用极细的固定相, 其目的是缩短在停滞流动相的扩散和传质的路径。,D 影响谱带展宽的其它因素, 非线性色谱：前面有关传质和扩散的讨论均假定分配等温线是线性的。事实上, 经常遇到的是非线性等温线, 特别是吸附色谱中, 因此造成峰“拖尾”和“伸舌头”现象, 使峰展宽, 对峰的基线宽度的影响尤为严重。 活性中心的影响：在气液色谱中, 有时会发现样品量很少时, 色谱峰拖尾, 若增加样品量, 峰的拖尾程度反而减少。这种现象显然不能由等温线的非线性加以解释, 而是由于载体表面的活性中心
16、对组分的吸附太强, 因此这些组分迟迟不得释放而造成拖尾。其解决办法是将载体预处理, 以除去表面活性中心。,对给定色谱体系, 当其它实验条件确定后, u对H的影响（速率曲线）可由实验来测得。将u以外的参数视作常数, 则速率方程可简化为(不考虑耦合效应)： H = AB/uCu 式中A、B、C为常数。上式中三项分别代表涡流扩散、纵向分子扩散和两相传质阻力对总塔板高度的贡献。 绘制H-u图时, 应选择若干不同的线速，包含高、中、低线速，测定组分的色谱峰, 计算出H值,然后作图。,总结果： u 较低时： B/u主导， u, H, u 较高时：Cu主导，u,H, u 最佳,2.4色谱分离度,柱效n 衡量柱效的指标是n(或neff)，柱效则反映了色谱分离过程的动力学性质。 容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比 选择性 为洗脱峰相临的两种溶质的容量因子之比. 分离度 图是两相邻组份在不同色谱条件下的分离情况。a）中
