【临床微生物实验】_嗜血杆菌军团菌属

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1、1,嗜血杆菌属Haemophilus,广州医科大学临床微生物检验室学习,2,3,流感嗜血杆菌菌名来自1892年流感世界大流行, 由费佛（Dr. Pfeiffer) 博士发现。 直至1933年将流感病毒分离成功才确认流感的真正病原体。 但流感嗜血杆菌这一错名却仍沿用至今。,4,嗜血杆菌属（Haemophilus）,与临床有关的9个种： 流感嗜血杆菌（H.influenzae） 副流感嗜血杆菌（H .parainfluenzae） 溶血嗜血杆菌（H .haemolyticus） 副溶血嗜血杆菌（H .parahemolyticus） 杜克嗜血杆菌（H .ducreyi） 埃及嗜血杆菌（H .aeg

2、yptius） 嗜沫嗜血杆菌（H .aphrophilus） 副嗜沫嗜血杆菌（H .paraphrophilus） 迟缓嗜血杆菌（H .segnis） 代表菌：流感嗜血杆菌（H .influenzae）,除这两菌外均不溶血,5,临床意义,致病因素： 荚膜：主要毒力因子 流感嗜血杆菌根据荚膜的有无分成： 有荚膜菌株（血清分型基础，b型毒力最强） 无荚膜菌株（较少侵略性） 菌毛：黏附作用 内毒素：发热等 该菌引起的感染常发生在病毒等引起的呼吸道感染之后,几种主要嗜血杆菌常栖部位及所致疾病,7,形态染色结构 1.G-小杆菌，球杆状 2.具有多形性（球 杆、长杆或丝状） 3.无芽胞，无鞭毛， 不能运动

3、 4.有荚膜菌株毒力较强,流感嗜血杆菌（H.influenzae）,8,流感嗜血杆菌革兰染色,铜绿假单胞菌革兰染色,9,10,根据荚膜多糖抗原不同分为a、b、c、d、e、f 6个血清型，b型致病性最强（Hib疫苗预防） 能分解葡萄糖、氧化酶（-）、触酶（+） 根据对吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶试验的生化反应不同分为8个生物型。,抗原性和生化反应,11,12,培养特性,分离培养： 需氧或兼性厌氧，需5-10%CO2 最适T 35-37 （杜克33） ，最适pH7.67.8 营养要求高 生长需要X和V因子（均存在于红细胞中）。 最适培养基为巧克力平板 菌落: 培养1824h，特殊的“鼠窝味”、不溶血

4、无荚膜菌株：灰白色、光滑、半透明小菌落 有荚膜菌株：灰白色、粘液样、半透明较大菌落 不同种型嗜血杆菌对X、V因子需求不相同,13,培养基：巧克力平板 血细胞中含有X、V因子，V因子处于抑制状态，加热80-90 5-15min破坏细胞膜上抑制物，可使V因子释放 巧克力琼脂中加入抗生素（万古霉素、杆菌肽）可提高检出率,培养特性,14,流感嗜血杆菌,巧克力平板：灰白色、半透明菌落,15,X因子 V因子 溶血 流感嗜血杆菌 + + - 副流感嗜血杆菌 - + - 嗜沫嗜血杆菌 - - - 副嗜沫嗜血杆菌 - + - 溶血嗜血杆菌 + + + 副溶血嗜血杆菌 - + + 杜克雷嗜血杆菌 + - - 埃及

5、嗜血杆菌 + + -,几种嗜血杆菌对生长因子需求,16,流感嗜血杆菌巧克力平板培养24h,17,培养48h后菌落,18,流感嗜血杆菌“卫星现象”（血平板上出现）,MH平板上金葡菌周围未见生长,血平板上金葡萄周围生长（左）,金黄色葡萄球菌可产生V因子，血细胞可提供X因子,19,抵抗力弱 对热敏感：5630min可杀死 对干燥、消毒剂等敏感 自溶酶 室温保存，4-5天转种一次,抵抗力,20,菌落特征: 巧克力平板上灰白色半透明菌落 卫星现象： 当流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血平板上共同培养时，由于金葡菌能合成释放V因子，并扩散到培养基中 ，可促进流感嗜血杆菌生长，在金葡菌周围生长的菌落较大，越远

6、越小直至没有。 因子生长试验： MH平板上贴上X、V、XV因子纸片，在所需因子纸片周围生长 生化反应 糖发酵试验,鉴 定,21,卫星试验 “卫星试验”是检测对V因子的需求，培养基加血与否是确定细菌对X因子的需求 流感仅在血平板上卫星试验（+），在MH上（-） 副流感仅需V因子，在血平板和MH平板上均可出现卫星现象。,22,卫星现象：金葡菌周围出现生长,流感嗜血杆菌,金葡菌,卫星现象(satellite phenomenon),23,流感嗜血杆菌,金葡菌,卫星现象,24,卫星现象,25,副流感嗜血杆菌V因子利用试验（MH平板）,26,流感嗜血杆菌： 氧化酶（-） 触酶试验（+） 葡萄糖（+）、蔗

7、糖、乳糖和甘露醇阴性、木糖多（+） 硝酸盐还原（+） 有荚膜菌吲哚（+） 无荚膜菌吲哚（-） 不溶血,生化反应,注：D为不同结果,嗜血杆菌属中种的特征,28,微生物学检验 标本采集：避免干燥 及时送检 分离培养：巧克力平板生长 血平板 不生长 检验程序,微生物学检验,血液 脑脊液 鼻咽拭子 痰 脓汁 增菌培养 分离培养 涂片镜检（G-小杆菌多形性） (巧克力平板 ) 抗原检测 35 5-10%CO2 18-24h 菌落形态 涂片镜检 卫星试验 荚膜肿胀试验 因子利用试验 (生化反应试验) 报告结果,30,药敏试验 采用KB法，用HTM（Haemophilus Test Medium Base)

8、培养基。 常规检测内酰胺酶和氯霉素 治疗用氨苄西林，阿莫西林，磺胺类，第二、三代头孢，红霉素，氨曲南等抗生素,31,鉴定依据（流感嗜血杆菌）,革兰阴性小杆菌或球杆菌 营养要求高，巧克力平板出现特征性的菌落，血平板不生长 卫星现象 需X、V两种因子 触酶试验（+） 荚膜肿胀试验（+） 不溶血 生化试验鉴定到种,32,X因子 V因子 溶血 流感嗜血杆菌 X+ V+ - 副流感嗜血杆菌 X- V+ - 嗜沫嗜血杆菌 X- V- - 副嗜沫嗜血杆菌 X- V+ - 溶血嗜血杆菌 X+ V+ + 副溶血嗜血杆菌 X- V+ + 杜克雷嗜血杆菌 X+ V- - 埃及嗜血杆菌 X+ V+ -,几种嗜血杆菌对

9、生长因子需求,33,Case study,原始资料： 临床诊断：肺炎,痰涂片革兰染色见大量脓细胞,及大量革兰阴性球杆菌 标本来源：痰 年龄：58 性别：女 试验说明：鉴定所有病原菌/做内酰酶试验及药敏试验,34,标本直接涂片革兰染色镜下图：效果一般，最后在边缘看到革兰阴性杆菌，但球杆菌并不多（镜下特征可排除卡他）,35,标本培养初步结果： 血平板：草绿溶血小菌落，无脐窝状菌落（排除）。 麦康凯平板：菌落少，无特征性(排除.)。 标本在巧克力平板（CA）上接种后形成中等大小灰白色半透明光滑湿润菌落，分纯、卫星试验、VX因子生长试验、生化鉴定,36,巧克力平板48h菌落,37,巧克力平板（CA）纯

10、培养革兰染色镜下,38,血平板上“卫星试验”阳性,39,MH平板上“卫星试验”阴性,40,MH平板上X、V因子利用生长试验,41,API生化鉴定条加试剂前,42,API生化鉴定条加试剂后（PEN孔黄色提示B内酰胺酶阳性） API NH鉴定编码：1424， 鉴定结果：流感嗜血杆菌。,43,ATB板条药敏实验,44,K-B法药敏,45,K-B法药敏,46,杜克雷嗜血杆菌 软下疳（性传播性疾病）患者病原菌，又称软下疳杆菌 革兰阴性短小杆菌，有两极浓染现象 取病灶标本涂片染色镜检见典型鱼群样排列可初步诊断,杜克雷嗜血杆菌,47,杜克嗜血杆菌引起的腹股沟软下疳（已破溃）,杜克雷嗜血杆菌,48,分泌物涂片

11、中杜克嗜血杆菌鱼群样排列,杜克雷嗜血杆菌,49,微生物学检查 镜检：溃疡取材涂片染色镜检。 培养：较为困难，国际上软下疳的标准培养基一种是GCHGS（Hammond gonococcal media），由淋球菌琼脂培养基加牛血红蛋白、胎牛血清、万古霉素及纤维素、氨基酸等组成；另外一种是MHHb（Muller-Hinton琼脂，由Muller-Hinton 琼脂、马血、万古霉素及其他培养成份组成）。 培养7天形成色灰黄而透亮，直径约1-2mm菌落。,杜克雷嗜血杆菌,军团菌属 Legionella,li:dnel,分 类,属于军团菌科（Legionellaceae）军团菌属(Legionella)

12、 常见的与人类疾病有关的军团菌： 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila） 15个血清型（根据O抗原不同分型） 米克戴德军团菌（L. micdadei） 长滩军团菌（L. longbeachae） 杜莫夫军团菌（L. dumoffii） 波兹曼军团菌（L. bozemanii） 等等,临床意义,军团菌在自然界的水环境中广泛存在，在人工管道 的水源（空调，制冷水塔，淋浴头等供水系统） 中及辅助呼吸机所产生的气溶胶中。 空气乳胶微粒传播 发病机制： 内毒素和细胞产生的多种酶 裂解红细胞 消化卵黄能力,临床意义,引起肺炎型和非肺炎型(庞蒂亚克热Pontiac fever)感染。 肺

13、炎型：多器官损害，肺部、消化道及神经系统 症状 及体征，致死率高。 非肺炎型：潜伏期短，似流感症状（发热，头痛，咳 嗽，乏力等），多自限性。 医院感染可高达23% 。 慢性器质性疾病、免疫功能低下如艾滋病或接受免疫抑制剂者易发本病，且死亡率高达45%。,生物学特性,1. 多见于水环境中。 2.革兰阴性杆菌、专性需氧。 3.无芽胞，无荚膜，有鞭毛 4.细胞内寄生，生长营养要求苛刻，需要L-半胱胺酸和铁离子,常用活性炭-酵母浸出液琼脂培养基（buffered charcoal-yeast extract agar,BCYE)。,培养嗜肺军团菌的BCYE平板,BCYE不含半胱氨酸,BCYE含半胱氨酸

14、,嗜肺军团菌生长需L半胱氨酸和铁,5.生化反应：（较少用于该菌鉴定） a.氧化酶试验:+/- b.触酶试验:+ c.不分解糖类、可液化明胶 d.马尿酸盐分解试验: + (嗜肺军团菌血清型4和15) - (其它军团菌),生物学特性,6.在体外的生长温度是25-45，最佳为35。 7.生长缓慢，约99分钟繁殖一代，一般培养3天可出现肉眼可见菌落。 8.抵抗力： 嗜肺军团菌在蒸馏水中可存活100天以上，在下水道污水中可存活1年，对热和常用化学消毒剂敏感，1%来苏水几分钟即可杀死，对氯作用的抵抗力比肠道菌大。,微生物学检验,临床标本：痰、气管分泌物、胸水和血液为主。 病理组织标本：必须制成悬液，再进行

15、涂片和分离培养。 环境标本：应先浓缩再接种。,标本处理,标本来源：临床标本(sputum),环境标本(water、soil) 标本处理： 1. 痰标本：60，2分钟 或者 酸处理 后接种 2. 胸水：离心取沉淀接种,军 团 菌 感 染 诊 断 试 验,军团菌诊断试验,分离培养与鉴定： 营养要求苛刻，生长缓慢 生长温度为35 最适pH6.77.0 初次分离必须采用BCYE 310天可形成12mm直径的光泽菌落 其他培养基不生长,军团菌肺炎 legionaires disease,临床表现： 起病急、疲乏无力、肌痛、头痛、畏寒、发热咳嗽、咳痰偶见咯血，1/3有胸痛、进行性呼吸困难，病情进展可发展成呼吸衰竭。腹痛腹泻、呕吐等消化系统症状，焦虑、淡漠、神志迟钝、谵妄等神经系统症状。,胸部X线检查,单侧或双侧肺泡浸润阴影,继而肺实变 肺下叶多见 免疫功能低下者可在阴影内出现空洞或肺脓肿,正常人肺部X片,治 疗,首选大环内酯类药物 红霉素1-2g/d,分4次口服或静脉 疗程为2-3周 也可选氟喹诺酮类 其他有效抗生素包括： 利福平、SMZ-TMP、四环素,分别选取一个菌落转种,根据菌落形状分组，记录菌落特征,*选取只在BCYE平板上生长的