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1、,亲和层析法,亲和层析法的基本介绍,操作过程,亲和层析法的应用,主要内容,制备方法,1、生物亲和作用,生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力，能区分结构和性质非常相近的其它分子。如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体等体系。 由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解决这一问题，一种有效的分离方法应运而生亲和层析(Affinity Chromatography，AC)，利用被分离的生命大分子物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为载体或担体
2、，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。,2、亲和作用的机理,结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离子、螯合剂等。,亲和层析载体的组成,配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。,原理,亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂； 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出； 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。,3
3、、特点,优点：上样量大，纯化过程简单、迅速，且分离效率高，被分离物质的活性不易丧失。特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子。 缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备成固相载体，在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。成本相对较昂贵。,4、亲和层析的分类,特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大。 通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者。,5、亲和层析的类型,根据配体
4、与生物大分子之间相互作用体系不同，可以把亲和层析分为： 生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受体等。 免疫亲和层析 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统。广泛应用于许多以单克隆抗体作为亲和配体的典型蛋白质纯化。 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品。,金属离子亲和层析 金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利
5、于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。 拟生物亲和层析 利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。,主要内容,制备方法,1、载体的选择,一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。,作为载体的物质应具有： 不溶性的多孔网状结构，渗透性好； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 抗微生物和酶的侵蚀； 最好为粒径均一的球形粒子
6、； 具有亲水性，无非特异性吸附； 含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。,例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。,2、配体的选择,一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。 依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素： 正确地预计被设计的配体构像 正确预计配体的亲和力 优良配体须具备的条件： 与待纯化的物质有较强的亲和力。 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配
7、体与待纯化物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是不利的。,具有与基质共价结合的基团,与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。,配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。,配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的条件，可以多次重复使用。,根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（genera
8、l ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素亲和素、抗原抗体、酶抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性。 通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。,亲和层析的基本原理,操作过程,亲和层析的应用,主要内容,制备方法,层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性
9、 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 洗脱：削弱目的产物和亲和吸附配体间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱,偶联,亲和层析剂,1、操作流程,非专一性洗脱： 改变温度 改变pH值 改变离子强度 专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合,2、基质活化,当用小分子化合为作为配体时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与配体之间引入适当长度的连接臂。 要使不溶性母体与配体偶联或通过连接臂与配体偶联，必须先使母体活化。即使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配体偶联。 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，
10、使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。,活化溴化腈活化法,溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：,缺点：基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、
11、易挥发，所以操作不便。,环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。,优点：活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，没有毒性。 缺点：用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等。,3、偶联,经过活化和洗涤过的基质与等体积的0.2-0.5mol/L碳酸盐缓冲液混合
12、，缓慢搅拌2小时，或室温下过夜，以便配体和基质充分偶联而形成固体载体。对于偶联极牢固会丧失活性的大分子物质配体，则应在低pH值缓冲液中反应或活化基质预先在pH8.3的碱性溶液中进行适当的水解作用，这样可提高配体的活性。 配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。,4、配体结合量的测定,配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体的量来表示，测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量的参数，具体测定方法有
13、直接测定法（2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验和根据配体的特征来进行测定）和间接测定法（推算法和根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量）。,5、洗脱,当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。,图8.2 亲和层析操作示意图,亲和层析的基本原理,操作步骤,目录,制备方法,亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药
14、物的分离极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。,抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为1071012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。,凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，con A
15、)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强。,辅酶和磷酸酰苷 各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine 5-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2，5-diphosphat
16、e，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。,过渡金属离子 Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+Ni2+Zn2+Co2+ 。,组氨酸 组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。 因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。这种亲和作用的机理尚不十分清楚。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。 肝素 肝素（heparin）是存
