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1、淋巴细胞的分离和功能检测 Separation and Assays for Lymphocytes,第一节 外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞 （peripheral blood mononucler cell，PBMC):单核细胞 淋巴细胞,人不同细胞的漂浮密度 红细胞：1.091.1 嗜酸性：1.091.095 嗜中性：1.0801.085 B细胞：1.0621.075 T细胞：1.0651.077 NK： 1.0501.070 单核细胞：1.0501.066 血小板：1.0301.060,Ficoll分层液分离法 属于单次密度梯度离心分离法 分离液组成： 聚蔗糖（商品名为Fico
2、ll） 泛影葡胺（常用商品为isopaque、hypaque） 故又称Ficoll-hypaque分层液,Ficoll： 分子量：40KD 高密度 低渗透压 无毒性 使用浓度：60g/L (密度：1.020） 泛影葡胺： 使用浓度：340g/L（密度：1.200）,Ficoll-hypaque的密度： 分离人外周淋巴细胞：1.0770.001 分离小鼠淋巴细胞 ：1.088 分离马淋巴细胞 ：1.090,操作过程： 将抗凝全血以Hanks液适当稀释后轻轻叠加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4 8 或冰浴）。 水平式离心（2000rpm，20min） 吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用,
3、密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）,细胞活性： 95% 单个核细胞纯度：95% 细胞获得率： 80% 最佳温度： 20,Percoll分离法 属于连续密度梯度离心分离法 Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒 扩散常数低，可形成稳定的梯度,操作： Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲液 高速离心，使分层液形成连续密度梯度 将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得到四个细胞层 吸取所需细胞层，洗涤备用,密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）,细胞活性：95% 细胞纯度： 98% 细胞获得率： 75% 最佳温度： 20,密度梯度离心法
4、注意事项： 无菌操作 安全防护 注意最佳温度操作 适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍，但要收集血浆成分则不能稀释）,第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化 外周血单个核细胞中还含有少量单核细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若特定试验要求应该除去这些成分.,红细胞去除法 低渗裂解法 PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。,氯化铵处理法 PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞,血小板去除法 离心洗涤法 HBSS或PBS洗涤分离的PBMC 2-3次，可去除大部分血小板。,单核细胞去除法 粘附法
5、单核细胞37下能粘附在塑料或玻璃表面，淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。 淋巴细胞纯度：95% 活性：95%,L-亮氨酸甲酯法 L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。 淋巴细胞纯度：99% 活性：95%,羰基铁吞噬法 单核细胞可吞噬羰基铁粉，吞噬后的细胞比重增大，分层液密度梯度离心时沉淀于管底。,免疫磁珠法 利用抗体致敏的磁珠与细胞结合，让细胞通过磁细胞分选仪，分离具有特异标记的免疫细胞。,第三节 外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分 离及纯化 T细胞及其亚群的选择性分离 尼龙
6、棉柱分离法 利用B细胞和单核细胞易于粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分离,操作： 将尼龙毛（聚酰胺纤维）填充于5-6mm内径的塑料管中，单个核细胞悬液加入，371-2小时，10%-20%FCS灌洗，收集洗脱液。,回收率：20%30% T细胞纯度：90% 一般不用于分离B细胞,花环形成法-E花环 成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体（CD2),可与绵羊红细胞结合形成花环，经Ficoll密度梯度离心，再经裂解即可获得T细胞。,T细胞回收率差异大 T细胞纯度：95% 分离过程可能激活某些T细胞,免疫磁珠分离法 将抗体与磁性微珠结合形成免疫磁珠（immmunomagnetic beads，
7、IMB),免疫磁珠与细胞结合后，在外加磁场的作用下，免疫磁珠-细胞复合物被吸附，从而起到分离的作用。 单克隆抗体-磁珠分离系统 （monoclonal antibody-magnetic cell sorting，MACS),阳性分离： 获得被吸附的细胞 阴性分离： 获取非吸附细胞,分离纯度：80%99% 得率：60%90%，仅次于流式细胞仪,CD4+ T细胞,流式细胞仪分选法 流式细胞术（flow cytometry，FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的分析和分选技术,流式细胞仪 流动室和液流系统 激光源和光学系统 光电管和检测系统 计算机和分析系统,细胞纯度：99% 细胞得率
8、：90% 细胞活性：95%,B细胞及其亚群的选择性分离 尼龙棉柱法 操作见T细胞分离部分 该法曾经是经典的B细胞分离方法，但收获率较低，现已很少使用,EA花环,B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb复合物中IgG Fc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。,免疫磁珠法 流式细胞分选法,细胞的保存及活力测定,保存 10%20%的灭活小牛血清等渗培养液重悬。 短期置4，长期：二甲亚砜+ -196 活力测定 台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着色。,第四节 淋巴细胞表面标记的检测 Assays for Lymphocyte Surface Markers,淋巴
9、细胞的表面标志,CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、M、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞,免疫荧光技术 直接法 间接法,微量细胞毒实验 针对表面标记的单抗与免疫细胞结合后，在补体的作用下会杀伤该细胞，细胞膜失去屏障作用，加入伊红染料后会将细胞染成红色，阴性细胞不着色。,免疫酶染技术 抗体用特异性的酶标记后不影响其与抗原结合，将酶标记抗体与免疫细胞作用，在酶底物存在时，阳性细胞将产生颜色反应，在光学显微镜下即可对免疫细胞进行定量和定性,ABC法（Avid
10、in-biotin-HRP complex ）,APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。,APAAP酶免疫桥联法,第五节 T、B淋巴细胞功能检测,一、T细胞功能检测,（一）T细胞增殖试验 T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应
11、。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test ,LTT),丝裂原诱导的增殖反应,技术方法 1. 用RPMI10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100l细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。 4. 37C ，5CO2，54h。 5. 配制浓度为50ci/ml的3HTdR。,T细胞增殖功能测定,丝裂原诱导的增
12、殖反应,6. 每孔加入50ci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。,T细胞增殖功能测定,丝裂原诱导的增殖反应,影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。 4. 微生物污
13、染：可降低细胞增殖能力。,T细胞增殖功能测定,单向混合淋巴细胞培养反应,原理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的
14、反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。,T细胞增殖功能测定,单向混合淋巴细胞培养试验,方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25g，37 C， 5C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37C，5CO2，46d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。,T细胞增殖功能测定,单向混合淋巴细胞培养,5
15、. 计算相对反应（RR） （实验组cpm阴性对照组cpm） RR 阳性对照组cpm阴性对照组cpm,T细胞增殖功能测定,单向混合淋巴细胞培养,注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。,T细胞增殖功能测定,成熟淋巴细胞,转化淋巴细胞,抗原诱导的特异性增殖反应,原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。,T细胞增殖功能测定,抗原性刺激物： 破伤风类毒素 链球菌激酶 纯化蛋白衍生物 白色链球菌 同种异型抗原（HLA),抗原诱导的特异性增殖反应,方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例） 1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10
