多糖的提取和分析方法

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1、多糖的提取和分析方法 刘 婷 周光明 (西南大学化学化工学院,重庆400715) 摘 要 对近年来多糖的最新提取和分析方法,按不同方面分析的分类对多糖的一些分析检测技术进行了综述,并 对各种检测技术从方法、 操作等方面进行了优缺点比较,为多糖分析的进一步发展研究提供参考。 关键词 多糖 提取 分析方法 收稿日期:2007 - 11 - 19 基金项目:重庆市自然科学基金(CSTC2007BB5370) 作者简介:刘婷(1984 ) , 女,硕士生;周光明(1964 ) , 男,教授,研究方向:分析化学 Extraction and Analytical method of Polysaccha

2、rides Liu TingZhou Guangming 3 (School of Chemistry and Chemical Engineering , Southwest University , Chongqing 400715) AbstractThe newest extraction and analytical method of polysaccharides in recent years was introduced , and some analysis and determination technology for polysaccharides were revi

3、ewed according to the classification of the different parts of analysis1Moreover , according to classification of the different aspectsof method and operationsof determination technology the comparison of the advantages and disadvantages were discussed1And the references for the further developments

4、 and re2 searchments of polysaccharides analysis were provided1The 44 references were adopted1 Keywordspolysaccharidesextractionanalytical method 糖类是自然界中存在最多的有机化合物,也是重 要的生物高分子化合物和信息物质。多糖(polysac2 charides ,PS)分布广泛,在高等植物,细菌,真菌,藻类 以及动物体内含量丰富。 20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复 杂多样的生物活性和功能19,如多糖有免疫调节功 能可作为广谱免疫促进剂,

5、作为药物可以治疗风湿 病,慢性病毒性肝炎,癌症等;还具有抗病毒,抗感染, 抗辐射,抗凝血,降血糖,降血脂,消除氧化自由基,促 进核酸与蛋白质的生物合成等作用。多糖的分析方 法也有很多,且日益受到人们的关注和研究。 1多糖的提取 多糖为大分子化合物,易溶于水,通常采用水提 醇沉法10,但耗时较长,且提取效率不高。为了提高 多糖的提取效率,在水提醇沉法的基础上发展了碱提 取法9,酸提取法11。此两种方法在大大提高多糖 提取率的同时,由于多糖不耐酸碱,因此会使部分多 糖分解,也存在着一定的不足。 谢红旗等12,利用酶法提起香菇多糖,将香菇 500 g ,粉碎,加适量水,加入115 %中性蛋白酶在50

6、 和pH值为418条件下酶解60 min ,加水至10 L ,然后 升温至95,使生物酶失活,在95 温度下药物提取 器中恒温提取2 h ,滤布过滤,收集滤液。酶解法可以 大大提高多糖的提取效率,并且降低蛋白质含量。但 药品价格较贵,温度控制严格,操作成本较高。 现发展出用超声波和微波辅助多糖提取法。李 俊等13,利用超声波辅助提取罗汉果多糖,取干燥、 粉碎的罗汉果100 g根据实验条件中入50 热水,超 声波提取3次,每次5 min ,合并各次提取液,减压浓 缩;往浓缩液中加入95 %乙醇使罗汉果多糖沉淀,高 速离心15 min得到沉淀,用丙酮洗涤5次,在- 50 下 冷冻干燥,得罗汉果粗多

7、糖。经过实验证明,超声波 辅助提取多糖明显提高多糖的提取率。 微波辅助提取是利用微波能的加热效应来加速 溶剂对固体样品中目标化合物的提取的新技术。邓 永智等14利用微波辅助提取法通过正交实验法从海 水小球藻中提取多糖,在70,功率为600 W,提取时 间为30 min的条件下海水小球藻中的多糖可以得到 较好的提取。超声波和微波辅助提取多糖操作简单, 且不会引入杂质,是很好的多糖提取方法。 2多糖的分析方法 211 多糖的含量分析 由于糖类具有还原性,在多糖的定量测定方面可 以根据糖的还原性进行测定,也可将糖转化成为糖醛 衍生物进行测定。 经典的多糖测定方法为苯酚-硫酸法15和蒽酮 -硫酸法16

8、,均以无水葡萄糖为对照品,分光光度法 测定,计算含量。这两种方法快速、 方便、 准确,但这 两种测定方法对有色样品都不理想,苯酚-硫酸法受 样品颜色的影响更大,因此常多用蒽酮-硫酸法测定 有色样品的总糖含量。汪东风17利用蒽酮-硫酸法 测定同一品种的红茶、 绿茶和乌龙茶的多糖含量,结 果分 别 为0185 %0101 % , 1141 %0106 % ,和 2163 %0127 % ,傅傅强等18认为这一结果偏低,主 要是以葡萄糖作标准曲线的原因,并提出以校正因子 修正测定结果,同时测定了江西獒源的红茶、 绿茶和 乌龙茶的茶多糖含量,分别为3 %315 %、4117 % 6135 %、3110

9、 %3153 %。比较两种计算方法的结 果,相差很大,一方面是因品种、 加工方法等的差异导 致的,另一方面是因为用作计算校正因子的茶多糖为 非纯品,使得校正因子偏大而导致的。 最近有学者比较研究了苯酚-硫酸法和间接碘 量法19测定灵芝多糖,间接碘量法可分别测定样品 中总糖和还原糖的含量,消除了样品还原性杂质的干 扰,所测结果更接近实际多糖含量。通过改进间接碘 量法,使滴定过程不需要在沸腾状态下进行,从而除 去了温度条件对滴定结果的干扰,使反应更易控制。 间接碘量法具有干扰少准确度高的特点,但与苯酚- 硫酸法相比,操作过程较为烦琐。 多糖含量的测定还有3 ,5 -二硝基水杨酸(DNS) 比色法,

10、该方法操作简单,快速,灵敏度高,杂质干扰 较小。王红英20等利用该法测定麦冬多糖含量,精 确度高。重现性好。是一种可取的多糖常规测定方 法。 212 多糖的组分分析 多糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相 色谱法( HPLC) ,气相色谱法( GC) ,薄层色谱法 (T LC) ,高效毛细管电泳法(HPCE)等。 杨兴斌等21采用1 -苯基- 3甲基- 5 -吡唑啉 酮(PMP)柱前衍生化反相高效液相色谱法,建立了9 种常见单糖的分离模式,并成功地用于当归多糖的单 糖组成分析,具有良好的重现性,结果表明,当归多糖 由甘露糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,葡萄糖, 半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组

11、成,其物质的量比为 01571100011331068116711712169。该方法灵敏 快速,准确,方便,可在线大批量分析。 邓永智等14,在MS参数:VF - 5MS毛细管色谱 柱(30 m0125 mm ,美国Varian公司 ) ; 进样口温度 280;柱箱起始温度120,3/ min至210,保持 4 min;载气为高纯氦气,流速110 mL/ min;离子化模 式为EI - Auto离子化能量70 eV;离子阱温度180; 接口温度280;质量扫描范围40550 amu的条件下 利用气相色谱-质谱联用法分析了海水小球藻多糖 的单糖组成。 颜军等22通过斑点分离度,清晰度,有无拖尾

12、现 象及展层时间等方面,利用薄层色谱法快速分析了多 糖的单糖组成,通过实验确定了适合的展开剂为展开 系统(乙酸乙脂 吡啶 无水乙醇 水= 8212) ,合适 的显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂。 耿越等23采用高效毛细管电泳法测定玉米花粉 多糖中单糖的组成,样品经水解后, 经 -萘胺衍生 化,电泳条件为:缓冲液为75 mmol/L硼砂溶液(pH = 915) ;柱温22;电压16 kV;检测波长200 nm;气压 进样,进样时间为5 s。测得玉米花粉多糖主要由葡 萄糖,阿拉伯糖和半乳糖3种单糖组成。该方法操作 简单,精度高,可成为测定多糖中单糖组分的方法。 周蓉24,季宇彬25等也利用高校毛细管

13、电泳法成功 分析了甘草多糖以及龙葵多糖的单糖组分。 综合各类方法,HPLC有分离速度快,分辨率高, 分离效率好,重现性好,不破坏样品的优点。但糖类 本身没有紫外吸收,只能采用示差折光监测器(R1) 或蒸发光散射检测器(ELSD)检测。RI分辨率低,而 ELSD效果虽好却价格昂贵。另外,采用HPLC分析 时,色谱柱的选择比较困难。一般采用氨基柱但分离 76 刘 婷等 多糖的提取和分析方法 20081Vol122 ,No. 3化工时刊 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

14、 效果不够理想,而专用的糖柱又十分昂贵。采用GC 测定糖类时,由于糖本身没有足够的挥发性,所以必 须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发以及对热 稳定的衍生物。此外,由于糖的异构化,在某些衍生 物的制备过程中,还会产生衍生物的异构化,使色谱 分析时每种糖产生多个峰,这往往影响组分的分离和 定量。液相色谱(T LC)是一种微量而快速的分析方 法,它兼备了柱层析和纸层析两者的优点而且操作方 便,设备简单,容易掌握,便宜,灵活的特点。但样品 不能回收,展开剂和显色剂的选择也要求严格。 HPCE技术具有样品用量少,时间短,灵敏度高,分离 效果明显的特点,在糖类物质的检测方面具有独特的 优势。 近年来,离

15、子色谱法测定糖类逐渐被学者们所关 注,离子色谱鉴于糖类化合物分子具有电化学活性及 在强碱溶液中呈离子化状态,Roxklin等26、 35于 1983 年首先报道了用阴离子交换色谱柱分离,脉冲安培检 测器测定糖的新方法(简称HPAEC)。常用浓度为 0101012 mol/LNaOH与NaAc作梯度淋洗。用改变 流动相pH值到接近这些糖类化合物的pKa值的方 法可明显增加分离的选择性2728。因为阴离子交 换分离是在碱性条件下完成的,检测方法必须与此相 匹配。用金电极的脉冲安培监测器适合这个条 件2933。Cai等34用高效阴离子交换色谱-脉冲安 培检测法直接同时分析了血清中多种糖类,利用梯度

16、洗脱在16 min内将葡萄糖、 核糖、 麦芽糖、 异麦芽糖分 离开来,再直接用脉冲安培法检测,无需衍生。T om2 maso等35也用该法成功分离测定了牛奶中的单糖及 多糖组分,效果良好。离子色谱法,操作简单,结果准 确,是一种快速、 便捷的检测方法。但由于离子色谱 对进样样品要求较高,样品前处理步骤要求严格,但 在糖类检测方面具有自身突出优势。 213 多糖的结构分析 多糖的结构分析在近年来采用了许多先进的仪 器设备,分析方法和手段都有了很大的提高。主要有 紫外光谱法、 红外光谱法和核磁共振分析法,现分别 介绍如下: 紫外光谱分析36:多糖样品溶于水中放置一夜, 在10 000 r/ min下离心20 min ,上清液加入乙醇沉淀。 沉淀用乙醚,丙酮洗涤,真空干燥,进行紫外扫描,在 270280 cm处有强吸收峰。 红外光谱分析:利用红外光谱,主要可以鉴定多 糖中是否含有硫酸基(1 2601 210 cm- 1)及硫酸基 的取代位置 (800 950 cm- 1)。红外光谱扫描茶叶多 糖具 有 一 般 多 糖 类 的 特 征 吸 收 峰( 4 000