固定化酶和细胞原理.

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1、第八章 固定化酶反应原理与技术,酶催化剂的优点： 专一性强， 反应条件温和， 反应速度较快。 弱点： 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难； 溶液酶稳定性差，易失活。,1969出现了固定化酶技术。 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制 或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。,概述,图8-1 生物催化剂作用方式示意,固定化酶的发展史,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,二 固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难,固定化酶的性质及其影响因素,一 影响固

2、定化酶性质的因素 二 固定化后酶性质的变化 三 评价固定化酶的指标,一 影响固定化酶性质的因素,1 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。,2 载体的影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响,二固定化后酶性质的变化,1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降,2 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高,2 固定化后酶稳定性提高的原因：

3、,a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。,3 pH的变化,PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。,1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。,载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 （2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低,4 最适温度变化,一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。

4、5 底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。,6 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化,由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境 Km=Km/(表观米氏常数) （1） 载体与底物带相同电荷，SiKm固定化酶降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则1,KmKm,三 评价固定化酶的指标：,1 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 计量单位 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位 品质的体现,三

5、 评价固定化酶的指标：,1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,3. 4. 或称偶联效率，活力保留百分数。 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力,四 固定化酶的活力测定方法介绍,1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。 2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具

6、有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量,3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。,固定化酶的性质及其影响因素提要,影响固定化酶性质的因素 固定化酶的性质 评价固定化酶的指标,酶本身的变化 载体的影响,固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适pH的变化 最适温度变化 底物特异性与游离酶不同 米氏常数Km的变化,评价指标 活力测定方法,固定化酶的制备,一 一般方法及特点 二 酶的固定化方法,一 一般方法及特点,关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳

7、定性研究、改进。 1 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）,各类固定化方法的特点比较:,2 选择方法依据：,（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择,3 固定化后酶的考察项目：,（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （ 3） 考察固定化酶最适反应条件,二 酶的固定化方法,（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method）,酶和细胞固定化示意图,（一） 吸附法,1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表

8、面上。,（一） 吸附法,常用载体： 无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂 有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂 研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷,（二）结合法,1 离子键结合法 2 共价键结合法,1 离子键结合法,概念 常用载体:DEAE-纤维素（功能团：二乙氨乙基） ， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度,2 共价键结合法,（1）概念 （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体,

9、（4）载体活化的方法,A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D硅烷化法 E溴化氰法,A重氮法,反应示意式如下,目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等 该方法需要载体具有芳香族氨基,反应式及原理,A重氮法例,5-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）,B 叠氮法,例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下： 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干

10、燥。 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。, 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶 (4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）,对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联,C烷基化反应法,D硅烷化法,多孔玻璃特点： 机械强度好

11、，表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。,一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。,E 溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.,（三）交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。,（三）交联法的形式,交联法有2种形式：酶直接交联法 酶辅助蛋白交联 双重固定法 （1） 吸附交联法 （2） 交联包埋法,酶直接交联法,在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。,酶辅助蛋白交联,为

12、避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质.,（1） 吸附交联法,先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。,（2）交联包埋法,把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。,（四） 包埋法（entrapping method）,定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。,包埋法分为网格型和微囊型 1网格型 2微囊型,1网格型,(1) 概念

13、 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法,2微囊型包埋法,是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。,微囊化法制备固定化酶有两种方法, 界面沉淀法 界面聚合法, 界面沉淀法,这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。,界面聚合法,是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界石上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。,固定化酶方法研究热点,1 热处理

14、法： 2 结晶法： 3 分散法：,固定化细胞的特点,所谓固定化细胞技术，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。固定化细胞与固定化酶技术一起组成了现代的固定化生物催化剂技术。,固定化细胞的优越性 无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本； 可进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易； 对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强； 细胞

15、生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围比固定化酶更为广泛。,应用范围 固定化细胞的应用范围极广，目前已遍及工业、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域。在工业方面，如利用产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果葡糖浆；将糖化酶与含淀粉酶的细菌、霉菌或酵母细胞一起共固定，可以直接将淀粉转化成葡萄糖；利用涨澡酸钙或卡拉胶包埋酵母菌，通过批式或连续发酵方式生产啤酒；利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒；此外，还可利用固定化细胞大量生产氨基酸、有机酸、抗生素、生化药物和甾体激素等发酵产品。在医学方面，如将固定化的胰岛细胞制

16、成微囊，能治疗糖尿病；用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，除上述医疗诊断外，还可测定醋酸、乙醇、谷氨酸、氨等。此外，固定化细胞在环境保护、产能和生化研究等领域都有着重要的应用。,吸附法,它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。,影响吸附法的主要因素,（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小 （2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质 （3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料,包埋固定法,包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。,包埋法分类,常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜