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1、1,胚胎培养,主讲教师 荣海燕,2,主要内容,含义 第一节 胚培养 第二节胚乳培养 第三节胚珠和子房培养 第四节 其它生殖器官培养 复习思考题,3,含义,采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。,4,5,胚电镜扫描图片,6,7,第一节 胚培养,一、培养类型 二、培养过程 三、培养基与培养条件 四、胚培养的应用,8,一、培养类型,9,顶细胞,多次分裂,球状胚体,子叶,胚芽,胚轴,胚根,几次分裂,胚柄,1吸收养料供胚发育 2产生激素促进胚发育,胚,（2N）,（2N）,（2N）,（2N）,（2N）,受精卵,荠菜胚的发育过程,10,一
2、.培养类型,1、离体胚培养时期 A.异养期 B.自养期 A.异养期，完全依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。B.自养期，胚能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代谢作用合成其生长所必需的物质。,11,2、离体胚培养类型 成熟胚培养 幼胚培养,12,幼胚培养（子叶形成之前） 成熟胚培养 （子叶形成以后）,据培养目的不同 剥取的离体胚发育时期的不同,胚培养,成熟胚培养一般较易获得成功,2、离体胚培养类型,13,1.幼胚培养过程 2.成熟胚培养过程,二.胚培养过程,14,（1）子房表面消毒后，在无菌条件和高倍解剖镜下切取完整胚，然后接种。,1.幼胚培养过程,15,适宜时间摘取子房,
3、70%酒精表面消毒30S,5%次氯酸钠液中灭菌10分钟,无菌水冲洗数次,无菌条件下取出胚珠,接种于固体培养基,培养,基本培养基： MSNistch White,剥去珠被取出幼胚,16,（2）幼胚培养的发育途径,按正常胚胎发育途径形成植株 胚“早熟萌发” 脱分化形成愈伤组织,17,按正常胚胎发育途径形成植株,成熟胚 未成熟胚,18, 胚“ 早熟萌发”,离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。,畸形苗,发育不正常而死（即胚性发育）,19,脱分化形成愈伤组织,离体胚,20,2.成熟胚培养过程,培养方法： A、将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70
4、%75%酒精表面消毒消毒几分钟 B、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗 C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上,21,22,成熟胚是自养的，培养基需要简单。 未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物质。胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂。,三、培养基与培养条件,23,荠菜不同发育时期胚培养的营养需要,24,1. 培养基：,White Rangwang MS B5
5、Nitsch 无机盐+糖(3-5%)+生长辅助物质(维生素、AA、椰乳等) 有利，光照不利于胚根生长。,25,幼胚需高无机盐、高AA、高蔗糖、高渗透压。 液体培养基利于幼胚培养，固体培养基利于成熟胚培养。,26,2.培养条件：,A.pH值在5.2-6.3，与植物有关。 B.温度：多数胚25，有的需变温或较低较高温度。 C.光照：通常弱光培养。光暗交替有利幼胚生长,27,原胚(幼胚)的培养的条件,无机氮： 渗透压： 复杂的天然提取物： 活性炭：,包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；,蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，初期高（WHY）。因为自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着。,椰乳 CM有促
6、进幼胚生长和分化的作用,吸附有毒物质,28,3 . 有利幼胚培养的因素 胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进作用。 胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要： 胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而且保留胚柄减少对胚的直接损失。,29,应用,克服远缘杂种的不育性。,败育,胚培养,30,使胚发育不全的植物获得后代。 缩短育种年限。 研究与胚发育有关的内外因素。,31,第二节胚乳培养,1. 胚乳 X3（2极核1精子） 是营养组织，影响胚的发育。 有些植物在胚发育过程中把胚乳消耗尽（豆科和葫芦科）； 有些植物，胚乳在成熟种子中存在，贮存大量营养物质（禾谷类，椰子，咖啡）,32,将胚乳从母体上分离出来，
7、放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。,含义,33,胚乳培养再生植株证明了全能性理论； 研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能； 再生植株多为三倍体，产生无籽果实； 可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株。 胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。,胚乳培养的意义,34,胚乳愈伤组织的建立 绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生），极少数直接从胚乳直接分化器官(胚状体)。 胚乳发育时期 发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。 处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织。 接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。,
8、胚乳培养的方法,35, 旺盛期胚乳特征 胚已分化完成 胚乳已形成细胞组织 充分生长，达到成熟大小 外观为半透明的固体状 富有弹性,36,水稻：授粉后4 d 黑麦草：授粉后8 10 d 黄瓜：授粉后7 16 d 梨：授粉后20 d 大麦：授粉后10 20 d 玉米和小麦：授粉后8 12 d,一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期,一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus 木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生callus,37,（一）培养基及植物生长物质 WT、MS植物激素 生长素细胞分裂素合理搭配，效果更好 一般植物 均适宜 特殊种类激素 如
9、: 大麦2,4-D 猕猴桃玉米素 无特别要求，任何一种生长素均可 如:枣,二.培养基与培养条件,38,旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的参与，就能形成愈伤组织。 完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。 胚在萌发时产生某种物质“ 胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。,（二）胚在胚乳培养中的作用,39,（三） 培养方法： A、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒 B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳 C、接种在培养基上，在25-27和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织 D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽 E、插入生根培养
10、基中，光下培养10-15d，切口处长出白色的不定根,40,胚乳培养过程,胚乳,胚状体发育成苗 不定芽苗,柚，柑桔和枣,大麦, 水稻, 玉米, 苹果, 马铃薯,41,（四）胚乳培养的应用 培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。 三倍体六倍体生产 倍性多样性筛选非整倍体植株 杂种胚乳附加系和换代系遗传育种,42,第三节胚珠和子房培养,胚囊,卵细胞,株心,珠 孔,反足细胞,珠 被,胚珠,极核,株柄,43,未受精胚珠,受精胚珠,愈伤组织,发育成种子,大孢子或卵分化为单倍体植株,再生植株,一、胚珠培养,直接成苗,44,一、胚珠培养,适宜时间摘取子房,70%酒精表面消毒30S,5%次氯酸钠液中灭菌1
11、0分钟,无菌水冲洗数次,无菌条件下取出胚珠,接种于固体培养基,培养,基本培养基： MSNistch White,45,不同植物的胚珠形态结构,46,胚珠培养的方法,长度小于3mm的胚珠，难与直接解剖，可先接种于液体培养基中，根据培养情况采取相应培养条件。,47,二、子房培养,1.摘取时间：在开花前15天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。 2.灭菌：禾谷类用70%酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15分；子房用70%酒精浸30秒，0.1%升汞1520分。无菌水冲洗，无菌滤纸吸干。,48,3.接种： 无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。 4.培养： T26,RH5
12、0-60%，16h散射光。,49,胚珠,花粉,试管内授粉,10d后,胚珠培养,3周后,离体受精及植株再生过程,50,三、胚珠和子房培养的应用 1、胚珠 受精胚珠培养目的打破种子的休眠 挽救胚的发育以获得杂交种 未受精胚珠培养目的获得单倍体细胞发育而来 的植株 2、子房 授粉子房培养目的挽救子房内杂种胚的发育 未授粉子房培养目的获得单倍体植株 试管受精解决杂交育种中不 亲和问题。,51,第四节 其它生殖器官培养一、花器培养,1.取材及处理 以健壮植株未开放花蕾为外植体，75%酒精浸30S，饱和漂白粉浸10-15分，无菌水冲洗数次。,2.培养基：MS、B5等,52,3.接种： 花蕾培养：花梗插入培
13、 养基中。 部分花器培养：切片接入 培养基中。,4.培养： 加入生长素和CTK，诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化成植株。,53,54,二、种子培养,优点： 1.植株分化容易，无菌操作方便，打破休眠。 2.使杂种败育种子正常萌发。,55,种子结构,56,培养方法： 1.种子消毒： 种皮厚或不饱满的用0.1%升汞浸10-20min，或用10%次氯酸钠浸15-20min。 幼嫩或发育不完全的用饱和漂白粉消毒15-30min。 壳厚难萌发种子可去壳培养。特殊可先用酒精、吐温40或80处理。,57,2.培养基： A.促种子萌发用MS培养基，加或不加激素，诱导愈伤组织则可加入6-BA或2,4-D。 B.无胚乳种子应适当加生长素。 C.一般糖浓度为1-3%。 D.打破休眠可加GA，或在接种前浸种处理。,3.接种培养：种子接入培养基。20-28，2000lx,光照12h。,58,复习思考题： 1、植物胚胎培养分为哪些类型？各有何种特点和要求？ 2、胚胎培养有何意义？ 3.花器官培养通常指花的哪些部分培养?常用的基本培养基是什么? 4.在进行幼胚培养时，由于幼胚过小而分离困难，可采取什么途径解决?,
