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1、1,Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作,10-12-2012,2,Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作,培训目的： 1.了解HPLC各模块的原理； 2. 掌握HPLC各模块日常维护的要点； 3. 掌握开机，关机。,3,Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作,内容： 一、 HPLC各模块的原理及维护； 二、开机/关机操作； 三、讨论； 四、评估。,4,一 、 HPLC各模块工作原理及维护,HPLC： 高效液相色谱仪（High Performances Liquid Chromatography）。 由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪
2、等几个部分组成。 工作时储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经样品进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。,5,关于溶剂,HPLC各模块的工作原理及维护,所有溶剂应为HPLC级，水应为二次超纯水； 所有溶剂应经过过滤。过滤水应使用水相滤膜，过滤有机相应使用有机相滤膜，不能混用。每一次滤膜只能用一次，不能重复使用； 如果没有在线脱气机，
3、所有溶剂应经过超声脱气； 水易滋生藻类，避免直接照射，过滤水最好使用不要超过两天； 如果条件允许可向溶剂中加入0.001-0.0001M的叠氮化钠； 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂； 避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂； 在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞，必要时小心拿下用强酸（35%硝酸）浸泡时，用水冲洗，但不要使用超声处理。,6,关于在线真空脱气机,在线真空脱气机的管路容量为12ml，压力范围为110Torr-190Torr。 为保证脱气机的良好使用性能，在下述情况下需要用注射器抽洗脱气机管路，每个通道使用不低于30ml的异丙醇。 1，新的脱气机或新的管路； 2，更换了溶剂，尤其
4、是缓冲盐与有机相之间、两个不相容流动相之间的互换时； 3，输液泵关闭了一段时间，或使用挥发性溶剂混合物。,HPLC各模块的工作原理及维护,7,关于泵：（四元泵）,HPLC各模块的工作原理及维护,8,关于泵（泵头组件）,出口球阀BOV,清洗阀Purge Valve,柱塞杆Piston,主动输入阀AV,HPLC各模块的工作原理及维护,活塞外框架,Seal Wash组件,泵头密封垫,泵腔,9,更换过滤白头,在清洗阀中的过滤白头需要更换，在清洗状态下，设置流量为5ml/min，此时系统压力如果超过10bar，则需更换过滤白头。 更换步骤： 1，关闭泵电源； 2，用扳手去掉通往进样器上的毛细管，拔掉废液
5、管； 3，用专用扳手小心把清洗阀卸下来； 4，轻轻去掉聚四氟乙烯密封垫和金密封垫，将过滤白头拿出； 5，更换新的过滤白头，装上聚四氟乙烯密封垫和金密封垫； 6，装上清洗阀； 7，连接管路。,过滤白头,聚四氟乙烯密封垫,金密封垫,清洗阀PurgeValve,HPLC各模块的工作原理及维护,10,更换过滤白头,1，去掉毛细管，废液管,2，卸掉清洗阀,3，更换过滤白头,4，更换白头，装好清洗阀,HPLC各模块的工作原理及维护,11,泵的注意事项,1，溶剂的过滤、脱气； 2，避免使用腐蚀性溶剂； 3，在满足分析的前提下，尽可能使用较低的流速较低的系统压力。 4，更换过滤白头； 5，考虑溶剂的相容性；
6、6，尽可能使用新鲜的水； 7，使用0.01M以上浓度的缓冲溶液要选配柱塞清洗组件，清洗液不能干涸。 8，使用正相溶剂比如环己烷时，建议使用聚乙烯密封垫，部件号为0905-1420，在0200Bar下使用聚乙烯密封垫比标准密封垫更耐磨损。,四元泵： 四元泵多通道比例阀MCGV使用时注意，缓冲溶液要放在A、D通道，以避免盐颗粒析出。建议A通道：水；B、C通道：有机溶剂；D通道：缓冲溶液。,HPLC各模块的工作原理及维护,12,关于进样器,HPLC各模块的工作原理及维护,13,关于进样器,准备位置,调用样品瓶 吸样品,进样和运行位置,标准进样过程 .,HPLC各模块的工作原理及维护,14,自动进样器
7、,样品要干净、经过过滤。 洗针：把样品残留降低到最小限度，可降低进样的记忆效应，洗针瓶最好不要加瓶垫。 多次吸液用于进样量大于100ul,HPLC各模块的工作原理及维护,15,关于恒温柱箱,控制范围：最高80C，低温低于室温10C。 预热块体积左面为3ul，右面为6ul，除非有特殊要求，左右温度应保持一致。 一定要关闭前面板。,HPLC各模块的工作原理及维护,16,关于原理,HPLC各模块的工作原理及维护,17,关于色谱柱保护,过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中的缓冲液。 柱子在不使用时，两端密封保存 在适当的溶剂中保存柱子 注意色谱柱的pH值使用范围
8、 不要高压冲洗柱子 不要高温下过长时间使用硅胶键合相,HPLC各模块的工作原理及维护,18,检测器DAD,DAD (Diode Array Detector)二极管阵列检测器，是以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器. DAD的光源氘灯有一定的半衰期，一般为1000小时左右，所以在没有样品分析任务时要关闭氘灯，以延长氘灯的使用寿命,但是也不要频繁的开关,这样也会影响寿命。同时，打开灯需要预热10min 左右，灯使用时间越长，预热的时间也要越长。 流动池污染后，会造成灵敏度下降、噪声加大，应避免脏的样品进入流动池。定期使用异丙醇冲洗系统对保持流动池性能有一定好处。,HPLC各模块的工作
9、原理及维护,19,检测器DAD,HPLC各模块的工作原理及维护,20,检测器FLD,HPLC各模块的工作原理及维护,FLD(Fluorescence Detector) 荧光检测器：是利用某些溶质在受到紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来检测的。 FLD是一款具有高度灵敏度和高度选择性的检测器。其激发光源是氙灯，此灯不需要预热。 其流通池和DAD的一样，也要定期用异丙醇冲洗，以保证性能。,21,检测器RID,HPLC各模块的工作原理及维护,22,二、 开机/关机操作,Seal wash Computer Power Chemstation Purge,SCPCP,23,开机操作： 1，打
10、开计算机。 2，打开LC各模块的电源，等待仪器自检完毕，1-2min。 3，双击桌面上“Instrument 1 Online”图标，进入化学工作站,在工作站打开各工作模块。 4，打开Seal Wash清洗液开关，清洗10min。 5，打开清洗阀，排除系统中的气泡，平衡差不多30min. 6, 拧上清洗阀，将流量设为所需流速，平衡30min即可以打样。,关机操作： 1，如果使用了缓冲溶液流动相应先用水冲洗系统30min。 2，用纯有机相冲洗系统30min。 3，在工作站上关闭各个模块。 4，退出工作站，关闭计算机。 5，关闭LC各个模块的电源。,二、 开机/关机操作,24,指示灯状态,开机/关
11、机操作,25,逆时针旋转打开清洗阀，清洗阀打开时，液体从废液管中流出，为清洗状态。 更换溶剂后，打开清洗阀，设置流量5ml/min，冲洗5-10 min. 顺时针旋紧清洗阀为关闭状态,此时流动相由毛细管流向进样器.,逆时针打开清洗阀,顺时针关闭清洗阀,毛细管出口,流向进样器,废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.,开机/关机操作,清洗阀Purge Valve,26,每次用过仪器后必须做!,整台液相色谱仪的维护,1. 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。 2. 关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为1520分钟，流量1ml/min。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。 3. 用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/min。本步骤主要是保护色谱柱。 4. 如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/min。,开/关机操作,27,三、实验及讨论 更换过滤白头（参照PPT 9-11） 四、评估,
