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1、word可编辑实用文档实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1学习和掌握 PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2认真完成每一步实验操作 ,详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于 DNA 的天然复制过程 ,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA的变性：模板 DNA 经加热至93左右一定时间后 ,使模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离 ,使之成为单链 ,以便它与引物结合 ,为下轮
2、反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后 ,温度降至55左右 ,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下 ,以dNTP为反应原料 ,靶序列为模板 ,按碱基配对与半保留复制原理 ,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程 ,就可获得更多的“半保留复制链” ,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟 ,23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 【实验用品】
3、1材料：重组质粒DNA作为模板 2器材和仪器：移液器及吸头 ,硅烷化的 PCR 小管 ,DNA扩增仪(PE 公司) ,琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪) ,台式高速离心机 3试剂： 10PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L TrisCl, 在 25下, pH9.0, 1.0 Triton X-100。 MgCl2 ：25mmol/L。 4 种 dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 Taq DNA聚合酶 5U/l。 T4 DNA连接酶及连接缓冲液： 【方法步骤】 （一）PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 35l H2 O 5l 10PCR反应缓冲液
4、4l 25mmol/L MgCl2 4l 4种dNTP 0.5l 上游引物（引物） 0.5l 下游引物（引物） 0.5l 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。 2. 将混合物在94下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5l约2.5U） ,混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。 3. 用94变性1分钟 ,45退火1分钟, 72延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72下保温10分钟 ,使反应产物扩增充分。 4 电泳 按前所述,取10l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。 注意 1. PCR
5、非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 【实验结果】 【注意事项】 微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化 【思考题 】 1. 降低退火温度对反应有何影响？ 2. 延长变性时间对反应有何影响？ 3. 循环次数是否越多越好？为何？ 4. PCR有哪些用途？举例说明。 附：PCR知识(供参考) （一）PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体
6、系： 10扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键 ,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理 论上 ,只要知道任何一段模板 DNA序列 ,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物 ,利用 PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-3
7、0bp ,常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp为宜 ,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜 ,G+C 太少扩增效果不佳 ,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布 ,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构 ,避免两条引物间互补 ,特别是 3端的互补 ,否则会形成引物二聚体 ,产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基 ,特别是最末及倒数第二个碱基 ,应严格要求配对 ,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点 ,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点 ,
8、这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol ,以最低引物量产生所需要的结果为好 ,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增 ,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度： 目前有两种 Taq DNA聚合酶供应 , 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 ,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时) ,浓度过高可引起非特异性扩增 ,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和 PCR
9、 扩增效率有密切关系 ,dNTP 粉呈颗粒状 ,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性 ,使用时应配成高浓度后 ,以 1M NaOH 或 1M Tris。HCl的缓冲液将其 PH调节到 7.07.5 ,小量分装 ,-20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中 ,dNTP 应为 50200umol/L , 尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制) , 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低) ,就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合 ,使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸：模板核酸的
10、量与纯化程度 ,是 PCR 成败与否的关键环节之一 ,传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质 ,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 ,并解离细胞中的核蛋白 ,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质 ,特别是与 DNA 结合的组蛋白 ,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份 ,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。一般临床检测标本 ,可采用快速简便的方法溶解细胞 ,裂解病原体 ,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离 ,直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异
11、硫氰酸胍或蛋白酶K 法 ,要防止 RNase降解 RNA。Mg2+ 浓度： Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响 ,在一般的 PCR 反应中 ,各种 dNTP 浓度为 200umol/L时 ,Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高 ,反应特异性降低 ,出现非特异扩增 ,浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性 ,使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法 ,双链 DNA 在 9095变性 ,再迅速冷却至 40
12、 60 ,引物退火并结合到靶序列上 ,然后快速升温至 7075 ,在 Taq DNA 聚合酶的作用下 ,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法 , 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一 ,一般采用 94变性 ,65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 变性温度与时间：变性温度低 ,解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下 ,9394lmin足以使模板 DNA变性 ,若低于 93则需延长时间 ,但温度不能过高 ,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性 ,就会导致 PCR 失
13、败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4060 ,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多 ,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间 ,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度 ,还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸 ,G+C 含量约 50%的引物 ,55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内 , 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合
14、 ,提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为3060sec ,足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于90时 , DNA合成几乎不能进行。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间 ,常用温度为 72 ,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间 ,可根据待扩增片段的长度而定 ,一般 1Kb以内的DNA片段 ,延伸时间1min是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会
15、导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增 ,延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 3040 次之间 ,循环次数越多 ,非特异性产物的量亦随之增多。 PCR 反应特点特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为： 引物与模板 DNA 特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性 ,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行 ,结合的特异性大大增加 ,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区 ,其特异性程度就更高。灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的 ,能将皮克(pg=10 -12 g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10 -6 g)水平。能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中 ,PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出
