分子生物学实验小技巧(最新-编写)

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1、分子生物学实验小技巧分子生物学实验小技巧 主要内容主要内容 1.SDS-PAGE 2.双向电泳双向电泳 3.质粒提取质粒提取 4.Western Blot 5.溶液配制溶液配制 6.PCR、酶切、连接并进行凝胶检测、酶切、连接并进行凝胶检测 7.RNA 提取与检测提取与检测 8.其他其他 SDS-PAGE 1.? ? ? SDS-PAGE 配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如 100ml） 预制胶，储存在 ） 预制胶，储存在 4 度冰箱（注：度冰箱（注：10% APS，TEMED 不加） ，每次配置时只需吸取 所需体积的预制胶加入相应体积

2、 不加） ，每次配置时只需吸取 所需体积的预制胶加入相应体积 APS，TEMED 即可，预制胶可储存半年以上， 能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。 。 即可，预制胶可储存半年以上， 能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。 。 2.? ? ? 配胶过程中，普通的配胶过程中，普通的 SDS-PAGE 中加入约中加入约 13%的甘油，可以提高分辨率， 有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成 的甘油，可以提高分辨率， 有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成 60%的甘油即 可。 。 的甘油即 可。 。 3.

3、? ? ? 胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶 槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免 胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放 胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶 槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免 胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放 4 度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下 梳子即可使用。 度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下 梳子即可使用。 4.? ? ? 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净即可） ，效 果较好。 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净

4、即可） ，效 果较好。 5.? ? ? 配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入 4以降低凝聚速度，而将凝胶放入以降低凝聚速度，而将凝胶放入 37 度促聚，并随时用度促聚，并随时用 4加剩的胶补充下降 的胶面；另外将胶横放与水平面成 加剩的胶补充下降 的胶面；另外将胶横放与水平面成 10 度角也可以减少收缩的影响。度角也可以减少收缩的影响。 6.? ? ? 丙烯酰胺放置时间过长（超过一年） ，会吸水潮解，导致胶不凝。 。丙烯酰胺放置时间过长（超过一年） ，会吸水潮解，导致胶不凝。 。 7.? ? ? 凝胶时温度高凝

5、胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，凝胶时温度高凝胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，25为宜。为宜。 8.? ? ? 氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。 。氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。 。 9.? ? ? 大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用 8M 尿素重悬细 胞后再煮效果较好。 尿素重悬细 胞后再煮效果较好。 10.? ?配好的配好的 10TBE 经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且 跑出的条带也很漂亮。 经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且 跑出的条带也很漂亮

6、。 11.? ?上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液 补全， 这样跑出的胶较为一致。 所有的加样孔都加样， 可以防止边缘的样品拖尾， 如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。 上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液 补全， 这样跑出的胶较为一致。 所有的加样孔都加样， 可以防止边缘的样品拖尾， 如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。 12.? ?跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以 低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差 不大的蛋白分离。 。 跑

7、胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以 低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差 不大的蛋白分离。 。 13.? ?跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶， 将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。 。 跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶， 将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。 。 14.? ?防止条带跑歪：分离胶配好后防止条带跑歪：分离胶配好后 4 度过夜；在点样的时候紧靠于上样两边的 点样孔各上 度过夜；在点样的时候紧靠

8、于上样两边的 点样孔各上 20 微上样缓冲液。微上样缓冲液。 15.? ?电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝 胶部分） ，一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易 能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着 水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。 。 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝 胶部分） ，一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易 能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着 水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就

9、会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。 。 16.? ?染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热 5-10 秒，不能 太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是 旧染色液，隔十分钟加热一次。 。 秒，不能 太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是 旧染色液，隔十分钟加热一次。 。 17.? ?脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸 5 分钟 左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效

10、果可能 比正常的脱色稍差一点点， 不如那样清楚， 只要电泳时比平时多上 分钟 左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效果可能 比正常的脱色稍差一点点， 不如那样清楚， 只要电泳时比平时多上 1/5 的样品就 可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液） 。 。 的样品就 可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液） 。 。 18.? ?用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点 甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸 水清洗

11、甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸 水清洗 7.8 遍，再重新染色，显色。遍，再重新染色，显色。 19.? ?脱色时用脱色时用 0.25M NaCl 代替脱色液，效果较好，无毒。 。代替脱色液，效果较好，无毒。 。 20.? ?脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸 附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。 。 脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸 附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。 。 双向电泳双向电泳 1.? ? ? 向电泳玻璃板内加入胶条时，先

12、在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要 加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样 可以很好的避免胶条下形成空气泡。 向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要 加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样 可以很好的避免胶条下形成空气泡。 2.? ? ? 一向电泳时， 盐离子容易聚在胶槽的两侧， 剪一小段一向电泳时， 盐离子容易聚在胶槽的两侧， 剪一小段 IPG 胶条放在两侧， 构成盐桥，电压就容易上去了，避免一向电泳不好影响最后实验结果。 。 胶条放在两侧， 构成盐桥，电压就容易上去了，避免一向电泳不好影响最后实验结果。 。

13、 3.? ? ? 在做第一相等电聚焦分离的时候，如果空气湿度大，除湿很重要（可通 过空调或除湿机） ，要不等电聚焦仪起的镀金电极会因为冷凝在上面的水汽产生 电火花而烧坏。 。 在做第一相等电聚焦分离的时候，如果空气湿度大，除湿很重要（可通 过空调或除湿机） ，要不等电聚焦仪起的镀金电极会因为冷凝在上面的水汽产生 电火花而烧坏。 。 ? 质粒提取质粒提取 1.? ? ? 质粒提取时，最后一步的酒精挥发对后续酶切等至关重要，尽量延长挥 发时间，最好是在空调的热风中挥发。 质粒提取时，最后一步的酒精挥发对后续酶切等至关重要，尽量延长挥 发时间，最好是在空调的热风中挥发。 2.? ? ? 加速燥的方法

14、，加速燥的方法，70%乙醇清洗过后，再加无水乙醇清洗再倒掉无水乙醇， 加速挥发。 。 乙醇清洗过后，再加无水乙醇清洗再倒掉无水乙醇， 加速挥发。 。 3.? ? ? 利用试剂盒中硅胶柱手提质粒，手提质粒时，配置的溶液一、溶液二、 溶液三 （代替试剂盒的 利用试剂盒中硅胶柱手提质粒，手提质粒时，配置的溶液一、溶液二、 溶液三 （代替试剂盒的 solution1、 2、 3） ， 然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠 （代 替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而只要是一样的质粒，试 剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制。 。 ） ， 然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠 （代 替结合

15、缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而只要是一样的质粒，试 剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制。 。 4.? ? ? 质粒提取的最后一步用质粒提取的最后一步用 TE（水）洗硅胶时，一般是加水后放置一分钟， 再离心收集 （水）洗硅胶时，一般是加水后放置一分钟， 再离心收集 DNA。可以加水后当即离心，再次把离心收集的液体重新加到硅胶 柱上，放置一分钟，离心，这样得到的质粒的回收率要高出 。可以加水后当即离心，再次把离心收集的液体重新加到硅胶 柱上，放置一分钟，离心，这样得到的质粒的回收率要高出 1030%，另外，同 一种质粒，用过的柱子可以反复使用（ ，另外，同 一种质粒，用过

16、的柱子可以反复使用（5 次） 。次） 。 。 Western Blot 1.? ? ? Western Blot 在摸索一抗、二抗浓度，封闭时间，曝光时间等条件时， 可以一次转膜后，将膜晾干，裁减成小块保存，每次取一小块进行条件摸索， 可以避免每次都重新跑胶、转膜甚至是重新提取蛋白，可以节省大量时间。 在摸索一抗、二抗浓度，封闭时间，曝光时间等条件时， 可以一次转膜后，将膜晾干，裁减成小块保存，每次取一小块进行条件摸索， 可以避免每次都重新跑胶、转膜甚至是重新提取蛋白，可以节省大量时间。 2.? ? ? Western Blot 时，转膜后暂存晾干的膜于时，转膜后暂存晾干的膜于 4条件下比将蛋白保存在条件下比将蛋白保存在 Buffer 中更可靠。 。中更可靠。 。 溶液配制溶液配制 1.? ? ? 培养基试剂等配制过程中可先将各成分配成母液，并在常用试剂瓶上写 上该试剂配方，方便配制。 培养基试剂等配制过程中可先将各成分配成母液，并在常用试剂瓶上写 上该试剂配方，方便配制。 2.? ? ? 剧毒物质配制过程中，以往是先根