《刘耀光_多靶点pCRISPR载体(单子叶和双子叶植物用)使用方法2020-4-14(new)(1)(最新-编写)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《刘耀光_多靶点pCRISPR载体(单子叶和双子叶植物用)使用方法2020-4-14(new)(1)(最新-编写)（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 CRISPR/Cas9-based genome editing technology A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 华南农业大学生命科学学院 刘耀光课题组 () 1. pYLCRISPR/Cas9 多靶点载体介绍多靶点载体介绍 CRISPR/Cas9 是新近发展的基因组编辑技术（图 1） 。CRISPR/Cas9 切割靶序列仅需要 single-guide RNA (s
2、gRNA)以及由 sgRNA 引导的 Cas9 蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs） ，TALENs 更加简便，高效，因而成 为基因组编辑工具的首选。 我们利用 CRISPR/Cas9 技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多 靶点 CRISPR/Cas9 基因打靶载体系统。 本套载体将 Cas9 蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个 sgRNA 表达盒的多克隆位点 Bsa I 位于 靠近双元载体 RB 位置。sgRNA 表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和 PCR 方法拼装好，再利 用 Golden Gate 或 Gibson Assembly 克隆方法组装
3、到双元载体上。 5 NNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Target Site PAMNNNNNNNNNNNN-3 3 NNNNNNNNNNNN NCCNNNNNNNNNNNN-5 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAG A A CGAUA GAA AACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU Cas9 nuclease Cleavage site genome sequence RuvC-like domain HNH domain CUUGAAAAAGUGGCACCGA
4、G CGUGGCU UUUUU-3 NGG Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB). 2 2CRISPR/Cas9 载体与载体与 sgRNA 载体图谱载体图谱 2.1CRISPR/Cas9 双元载体 本套载体系统的双元载体骨架为 pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p 为本实验室设
5、计合 成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有 5端 GC 含量较高的特征 (Figure 2)。 这些质粒在 E. coli TOP10F(LacIq) 菌株繁殖，该菌株 LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制 ccdB 大肠杆 菌致死基因的表达。 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B 载体中的 Cas9p 用 pUbi 驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子 叶植物， 目前优先使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B。 我们用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥也打靶成功， 但与 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 对拟南芥的打
6、靶效率比较正在测试中。 我们对 pYLCRISPR/Cas9 载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表 1。 Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants. pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H), Bar (-B), and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin p
7、hosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cutting sties Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R) for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a sh
8、orten form of the ccdB negative selection gene. 3 表一表一 pYLCRISPR/Cas9 载体新旧命名对应关系载体新旧命名对应关系 新命名原命名适用植物种植物抗性 pYLCRISPR/Cas9Pubi-HpYLCRISPR/Cas9-MH, pYLCRISPR/Cas9-MTmono 单子叶/双子叶潮霉素 pYLCRISPR/Cas9Pubi-BpYLCRISPR/Cas9-MB单子叶/双子叶草甘磷 pYLCRISPR/Cas9P35S-HpYLCRISPR/Cas9-DH双子叶潮霉素 pYLCRISPR/Cas9P35S-BpYLCRISPR
9、/Cas9-DB双子叶草甘磷 pYLCRISPR/Cas9P35S-NpYLCRISPR/Cas9-DN双子叶卡那霉素 2.2 CRISPR/sgRNA vectors sgRNA 序列全长 96 nt，分为两部分，5决定靶序列的 20 碱基 (seed sequence)和 3区域为保守的结构序 列。因此构建针对特定靶位点的 sgRNA，只需要克隆决定靶序列的 5端 20 nt (seed sequence)。 sgRNA 用 small nuclear (sn) RNA U6/U3 启动子驱动，以保证转录出的 sgRNA 停留在细胞核中与 Cas9 结合。 本方案用 PCR 扩增的方法构建
10、包含靶序列的 sgRNA 表达盒，并在扩增引物 5端引入顺次排列的位置 特异 Bsa I 酶切位点，用于 Golden Gate 克隆。或在扩增引物 5端加入互补序列用于 Gibson Assembly 连接 克隆。 为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中 sgRNA 表达盒之间发生同源 重组，从水稻克隆了 4 个不同 snRNA 启动子(OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c)，用于单子叶植物；从拟南芥 中克隆了 4 个不同 snRNA 启动子（AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29） ，用于双子叶植物。 4 Figure 3(A) Overal
11、l structure of eight basic sgRNA intermediate vectors. (B) The two Bsa I cutting sequences are given in twelve sgRNA vectors (in a linear form), including other four vectors (pYLsgRNA-OsU3/LacZ, pYLsgRNA-OsU6a/LacZ, pYLsgRNA-AtU3b/LacZ, and pYLsgRNA- AtU3d/LacZ) that have an additional LacZ gene (19
12、8 bp) as a cloning selection marker. The U3 and U6 promoters from rice (Os) and Arabidopsis (At) and the sgRNA sequence are separated by the vector backbone, to avoid amplification of the uncut plasmids by PCR with short extension time during the construction of sgRNA expression cassettes. Cutting (
13、small arrows) with Bsa I produces different non-palindromic sticky ends to the promoters and an end to the sgRNA sequence. (C) A representative regular target and an irregular target, their target adaptors for the OsU6a promoter, and the transcribed 5 sequences are shown. A ligated target-sgRNA expr
14、ession cassette is amplified by nested PCR using primers U-F/gR-R and Pps/Pgs. Pps and Pgs are position-specific primers with Bsa I sites for the Golden Gate ligation (Table S1), or with overlapping ends for Gibson Assembly (Table S3). 3.靶位点选择和接头设计3.靶位点选择和接头设计 3.1 靶位点选择靶位点选择 建议对建议对 1 个目的基因设计个目的基因设计
15、2 个靶点个靶点(尤其只有一个靶基因尤其只有一个靶基因)， 以降低某靶点打靶不成功的风险。 可在， 以降低某靶点打靶不成功的风险。 可在 ORF 5区和功能结构域各设计区和功能结构域各设计 1 个靶点，使之任何个靶点，使之任何 1 个靶点的突变都可以产生功能缺失，或个靶点的突变都可以产生功能缺失，或 2 个靶点之间的序 列被敲除。设计靶点的原则： 个靶点之间的序 列被敲除。设计靶点的原则： (1) 目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点； (2) Regular targets 另外注意设计引物（尤 其反向引物）时
16、的 5-3方向。 （2）如果 NGG 上游第 20 碱基不是 A 或 G，作为非常规靶点(irregular target)，将 20 碱基为靶序列合成接 头的形式 5-NNNNNNNNN( (T T/ /C C) )N NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NG GG GNNNNNNNNN-3 PAM 5-gtcA( (T T/ /C C) )N NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN N-3 3-( (A A/ /G G) )N NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NN NCAAA-5 合成接头的形式： （对AtU3b启动子） 20 nt 20 nt 非常规靶点（irregular target）接头的形式 也就是说，所用启动子的转录起始点与 NGG 上游第 20 碱基相同的 regular 靶点就是合成 19 碱基+4 碱 基粘性末端
