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1、第一章 化学发光技术一、 免疫学检测发展阶段免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程，如图1.1所示。化学发光免疫检测（CLIA）酶联免疫检测（ELISA）放射免疫检测（RIA）20世纪 60年代 70年代 90年代 时间图1.1免疫学检测发展阶段尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态，亟待改进。下表.就此做一比较：表1.1 中国免
2、疫诊断现状中国国际（欧美为主）放射免疫法（）兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院；产品处于衰退期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。兴起于20世纪60年代，现已基本退出临床应用；产品生命周期已终结；厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。酶联免疫法（）兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法；产品处于成熟期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂尚未系列化。兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用；产品处于衰退期；厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。化学发光免疫法（）导入于20世纪90年代，现个别较大医院开展个别项目；产品处于导入期或成长期；无
3、厂商开发生产，完全依赖进口。兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法；产品处于成熟期；厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态好。 由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是大势所趋；而取代进口，发展我国的化学发光检测事业，正是临床检验界着手发展的方向。由此，我公司自1998年立项至今，致利于化学发光检测方案设计，自行开发了具有国内领先水平的化学发光底物，与国外知名检测仪器生产商联合开发了化学发光全自动、半自动检测仪，并自行设计开发了化学发光管理软件，而今形成了仪器、试剂、软件全面配套，为我国的临床检验界提供了一套完善的解决方案。二、 化学发光免疫分析
4、技术【概述】本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同这处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的
5、操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。【原理】在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式，如图1.2，1.3，1.4所示。如图1.2双抗体夹心法反应原理示意图化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光
6、信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。具体说来，我们采用的是辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（Luminol）底物发光系统，如图1.5所示。我们的核心技术之一在于自行研制开发的发光底物系统，该系统与国外同类产品的比较表明，不仅主要性能指标达到了国外产品水平，并且由于自行生产，因此大大降低了发光底物的成本。在该底物系统中，我们采用特殊的复合型增强剂，发光快，强度高，发光平台期长，可达3060分钟，因此完全可以满足临床检测的需要。其发光平台期测定结果如图1.6所示（1）与放免（RIA）产品比较 与放射免疫试剂（R
7、IA）比较，化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害，大大缩短了反应时间，同时兼具高灵敏度的优势。 （2）与酶免（ELISA）产品比较 灵敏度与可测范围远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。 （3）与进口全自动发光比较试剂成本远远低于进口全自动发光试剂，为开放体系，也可适用其他发光检测仪器检测。【应用】发光免疫分析作为一种非放射性免疫标记技术，除了具有灵敏、特异、标记物稳定等特点外，其检测程序亦简便、快速，只需微量标本，近年来临床上已应用于检测各种激素、肿瘤标志物、药物及其他微量生物活性物质，亦可用于细菌和病毒感染的快速诊断。三、 技术优势【技术路线的确定
8、】为适应中国临床检验的实际需要，我公司确定了以下的技术路线，如下表1.7所示：【技术鉴定】（1） 化学发光试剂的现状 已通过河北省科委鉴定： 国外进口发光剂对比结果：符合率为98%，部分技术指标超过进口发光剂。 甲胎蛋白（AFP）化学发光定量检测试剂盒：已通过中国药品生物制品检定所检定，各项指标优异。 癌抗原125（CA125）化学发光定量检测试剂盒：已通过中国药品生物制品检定所检定，各项指标优异。 催乳素（PRL）化学发光定量检测试剂盒：已通过中国药品生物制品检定所检定，各项指标优异。（2） 化学发光仪及软件 化学发光分析管理软件已开发完成，可实现程序测量、快速测量、单板多项、两点定标、自动
9、打印化验单、工作量统计等功能。 表1.7技术路线思路确定技术路线思路标准微孔板为反应载体操作简便、易于标准化标记辣根过氧化物酶应用广泛、标记技术稳定鲁米诺底物系统针对辣根过氧化物酶，发光强度大，扩展性强全自动、半自动发光仪适合不同层次用户的需要中文操作软件方便国内临床免疫学检测实验室四、 产品介绍【系列试剂盒】现有试剂盒共有5个系列，20余种产品。（1） 肿瘤标志物系列：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、血清铁蛋白（SF）、2微球蛋白（2-MG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、前列腺特异性抗原（PSA）、游离前列腺特异性抗原（f-PSA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原15-3（CA
10、15-3）、癌抗原19-9（CA19-9）（2） 甲状腺功能系列：甲状腺素（T4）、游离甲状腺素（FT4）、三碘甲腺原氨酸（T3）、游离三碘甲腺原氨酸（FT3）、促甲状腺素（TSH）（3） 生殖内分泌激素系列：催乳素（PRL）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激激素（FSH）、孕酮（P）、睾酮（T）、雌二醇（E2）（4） 糖尿病系列：胰岛素、血清C肽（5） 其他检测系列：皮质醇、总lgE、生长激素（GH）【试剂盒评价标准】从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到100%可靠的试验，任何试验都会出现假阴性或假阳性。以下指标为评价一个试剂盒的常用指标，
11、不同的试剂盒将根据不同的标准进行评价。（1） 准确性准确性是指测定所得值与真值的一致性。（2） 精密性精密度是指对同一份样品重复测定，每次测定结果和均值的接近程度。（3） 灵敏度灵敏度是指某种试验检出极低免疫物质的能力。（4） 特异性特异性是指以无病者试验，其阴性的百分率。（5） 稳定性是指试剂盒在有效期内保持稳定的程度。【试剂盒操作注意事项】（1） 发光反应最适温度在2528，为保证试验测定的准确性，应严格控制实验室温度在1825。（2） 发光反应灵敏度很高，因此需要严格按照说明书要求，控制每步反应时间，操作应紧凑。（3） 处理试剂和样品时需戴一次性手套，操作后应彻底洗手。（4） 所有标本应
12、视为潜在的传染性物质，废弃处理时，请按照当地政府和有关国家规定进行。（5） 操作前仔细阅读使用说明书，不同批号的试剂不得混用。（6） 包被条打开后，应将剩余包被条用密封保存，以免受潮。（7） 加样头不可混用，以免交叉感染。（8） 为避免边缘效应，建议温育过程中将微孔板用封膜覆盖。（9） 洗涤要彻底，洗液应注满每孔，避免产生气泡。每次洗涤均应甩干孔内液体。但不可用水过猛，最后应将孔内液体拍干。（10） 建议各实验室根据自己实际条件建立临界值范围。本试剂盒仅作其他诊断方法的辅助手段之一，供医生参考。（11） 试剂请在有效期内使用。第二章 肿瘤标志物检测一、肿瘤标志物简介近年来，肿瘤已成为危害人类生
13、命健康的常见病、多发病。肿瘤根据来源可分为瘤和癌，按照性质可分为良性和恶性。肿瘤的发生直接影响机体的代谢，如改变糖的代谢途径，改变蛋白质与核酸的合成，改变代谢过程中关键酶的活性，以及引起激素代谢异常等。以蛋白质为例，肿瘤组织中的蛋白质含量要比正常组织高。作为可用于肿瘤标志检测蛋白质来讲，属于肿瘤组织自身增值中合成的标志蛋白质或酶均见增高，而属于肿瘤细胞分化标志的蛋白质或酶，其合成往往成减低趋势。并且通过研究发现，在哺乳类动物胚胎期所具有蛋白质，随着年龄增长其结构有所改变，当人体出生后或随着年龄变化，某些基因被关闭，不再表达或很少表达该基因的活性，当癌变时，某些细胞退化成为分化较差的、近似于胚胎
14、细胞时，使得某些基因失活，某些基因被激活，重新合成一些胚胎蛋白，如甲胎蛋白、癌胚抗原等，这一现象称为返祖现象。这即为肿瘤标志物的检测建立了科学基础。所谓肿瘤标志物（tumormarker,TM），是指由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身，或分泌至血液或其他体液，或因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质。肿瘤标志物的检测，对于肿瘤的早期发现，病情的发展、治疗后的评价、监测复发和转移等方面都具有一定的应用价值，可以为患者争取治疗时间，延长患者生命。因而近年来，世界许多医学科学工作者致力于对肿瘤细胞生长各环节、代谢与调控的基本规律和变化研究，寻求新的特异性或相对特异性的肿瘤标
15、志物。二、瘤标志物的分类肿瘤胚胎性抗原标志物该类蛋白质即前文所提到的因返祖现象的出现，而产生的肿瘤标志物。虽然该类标志物与肿瘤组织不一定具有特定的相关性，但与肿瘤的发生存在着内在的联系。例：甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）糖类抗原标志物该类物质是肿瘤细胞表面的抗原物质，或肿瘤细胞所分泌的物质。这类标志物的出现为临床肿瘤的诊断带来方便，但其命名无规律可言。有些是肿瘤细胞株编号，有些是抗体物质的编号。该类标志物又可分为两类1糖类高分子粘蛋白抗原例：癌抗原CA125癌抗原CA15-32血型类抗原例：癌抗原CA19-9癌抗原CA50酶类标志物酶及同工酶是最早
