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1、常见疫病实验室检测方法最全常见疫病实验室检测方法 目录常见疫病实验室检测方法1目录1常见ELISA操作方法2亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒2猪瘟抗原检测试剂盒5猪瘟病毒抗体阻断ELISA试验11猪瘟单抗酶联免疫吸附试验13口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA）15口蹄疫抗体液相阻断-酶联免疫吸附试验17PRRS抗体间接酶联免疫吸附试验21犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书23犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书25常见PCR操作方法27猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒27猪圆环病毒PCR诊断试剂盒30常见RT-PCR操作方法33口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒33
2、H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒说明书(20次)35新城疫病毒RT-PCR 检测试剂盒37猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒40凝集、血凝实验操作方法43弓形虫间接血凝试验(lHA)试剂使用说明书43伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒44猪细小病毒病乳胶凝集试验LAT诊断试剂盒使用说明书45猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验LAT操作程序46猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序47口蹄疫正向间接血凝试验50高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序51琼脂扩散试验53鸡马立克氏病53禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验55荧光抗体检测57猪瘟荧光抗体试验操作程序57对狂犬病疑似动物脑组织的
3、直接免疫荧光(dFA)检测58血清学诊断检测常用试剂配方60禽流感HA和HI试验用溶液的配制60补充实验63猪流感病毒H1亚型Hl试验抗原与阴、阳性血清说明书63猪流感病毒RT-PCR检测66猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp2 15941680变异株）RT-PCR检测实验68一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清71二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验72动物结核病诊断操作规程73常见ELISA操作方法亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒一 试剂盒内含物.说明书 亚洲 1 型口蹄疫阳性对照血清( 己稀释浓度为 1:8).96 孔 ELISA 板 亚洲
4、1 型口蹄疫阴性对照血清.液体稀释槽 3% 双氧水.U 型96孔抗原抗体反应板 25PBST洗涤液(稀释时准确量取).封板膜 豚鼠抗血清稀释液.灭活亚洲型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液.亚洲型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊.亚洲型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲液片剂.兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂二 器材准备 ( 需用户自备 )1.移液器:5-50l移液器、0.210l移液器、50200l移液器、50300l 12道移液器各一把。2.移液枪尖 (若干)。3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,
5、用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。三、试剂准备(需用户完成)1.包被缓冲液(PH9.6)将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4存放,1月内有效。2. 洗涤液(PBST)将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)3.底物溶液取1片柠檬酸磷酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液
6、, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml瓶 ), 避光之-2O保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10L 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H202) 。务必加双氧水!四、操作步骤 1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50l, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图S1 1:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-
7、1:41:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图 1
8、为例 , 在 U 型血凝板上按 50 l/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100l。振荡混匀,封板,4过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。3.用洗涤液 (1PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50l封板,37温育1小时。4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释
9、亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50l,封板,37温育1小时。5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 lPBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 l 封板 ,37 温育 1 小时。6. 同上洗板5次,每孔加50l底物溶液 (务必加双氧水),37温育15分钟。每孔再加50l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。五 结果判定1. 试验认可标准每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50l/孔,病毒抗原对照OD49
10、2nm 值应在1.50.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:10241滴度以内,阴性对照血清抗体效价应1:8。2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。3.结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.
11、2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度1:128 。ELISA抗体效价1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。 ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价1:128,99% 保护；效价1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。猪瘟抗原检测试剂盒Classical Swin
12、e Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)概 述猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)都是瘟病毒科黄病毒属的成员。猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起猪的严重死亡。感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感
13、染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。原 理本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。通过酶标仪测定其吸光度。可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。试 剂本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品(每个样品1孔，每个对照2孔)或46个样品(每个样品2孔，每个对照2孔)；或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品(每个样品2孔)。为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。试 剂 数 量1、多克隆羊抗血清包被板条 8孔12条(96孔)
