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1、梅里埃快速病原体检测解决方案多重呼吸道病原体检测项目建议书提供精准快速的病原体结果流行病数据与现状呼吸道感染：呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。呼吸道感染通常由病毒、细菌、非典型病原体等引起，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择对应的治疗方案。呼吸道感染是临床的常见病，其发病具有着明显的季节性：甲型流感在中国北方多出现于每年1-2月，而在中部地区亦可多出现于6-8月，在南方地区则多现于每年的4-6月；而乙型流感则多发于寒冷季节。中国各个地区流感发病率表格引自Yu H等“Characterization of Regional Influenza Seasonal
2、ity Patterns in China and Implications for Vaccination Strategies: Spatio-Temporal Modeling of Surveillance Data”我国主要的流感病原体是甲型流感H1和H3型以及乙型流感。除了甲型流感和乙型流感之外，其他多种病原体也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、肠病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。急性呼吸道感染的发生同人体免疫力降低有着直接的关系，儿童和老年人都是易感人群。一项针对儿童患者的流行病学研究发现：肠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒是造成儿童急性上
3、呼吸道感染的主要病原体。引起儿童急性呼吸道感染的致病体表格引自顾艳红等“儿童急性呼吸道感染夏季和冬季病毒病原学分析”中国儿童普通感冒规范诊治专家共识（2013年）中指出，病毒的病原学地位突出,其中以鼻病毒最常见(30% 50%),其 次 为 冠 状 病 毒(10% 15%)、呼 吸 道 合 胞 病 毒 ( 5 % ) 、副 流 感 病 毒 ( 5 % ) 、腺 病 毒 ( 5 % ) 和 肠 道 病 毒 ( 5%)等。对于新生儿和低龄儿童，呼吸道合胞病毒具有非常强的传染性和致病性，因此对于呼吸道合胞病毒的爆发和医院内感染需要特别的重视；另外由于腺病毒造成的呼吸道感染往往病情较重，所以对于腺病毒
4、感染的快速病原体确认也是十分重要的。一项 2015 年 WHO 在 12 个国家开展的调查显示，64% 的大众受调查者认为抗菌药物可以用来治疗病毒及病毒感染所导致的流感和普通感冒。常识的缺乏，导致了患者和一些医生，滥用抗菌药物。WHO的统计数据表明，中国真正需要使用抗生素的病人不到20%, 抗生素的不合理使用会引起细菌的耐药性，耐药性往往会导致很多严重感染治疗无效，给患者健康乃至生命造成重大影响. WHO曾发表全球抗菌素耐药性报告称，如果不能迅速采取措施应对这一问题，世界将迈向“后抗生素时代”，呼吁各国加强在抗生素耐药方面的合作。病原体的明确诊断对于指导有效合理使用抗生素发挥着至关重要的作用,
5、 这是遏制抗生素耐药出现的关键. 抗击抗生素耐药性需要涵盖全方面的临床诊断方案: 微生物鉴定和药敏试验, 感染性疾病筛查和主动监测,疫情管理和监测,细菌以及病毒感染的病原确定和分型. 2016中国儿童流感指南中提出，在流感病人出现症状的48小时之内使用奥司他韦（达菲）可以明显提高治疗成功率、缩短病程。非典型病原体，如社区性获得性肺炎（CAP）中的肺炎支原体（M.pneumonia），需要使用阿奇霉素或者红霉素进行治疗，而不是光谱抗生素。只有快速明确病原体及其药敏结果, 才能够准确的治疗，遏制抗生素耐药性的发生, 从而有效进行抗生素管理，达到精准治疗的目的.目前呼吸道病原体诊断方法：目前呼吸道病
6、原体中，细菌通常可以通过传统的培养方法解决，大体上需要2448小时。非典型病原体，如肺炎支原体，肺炎衣原体等通常采用血清抗体检测，或分子检测。病毒的检测则有所不同，传统的培养，血清学都难以跨越性能和检测种类的限制。2015年儿童流感诊断与治疗专家共识中提出，确认流感病例需要以下1项或1项以上实验室检测阳性者，可以确诊流感：1， 流感病毒核酸检测阳性。2， 流感病毒快速抗原检测阳性，结合流行病学史判断。3， 流感病毒分离培养阳性。4， 恢复期较急性期血清抗流感病毒特异性IgG抗体水平呈4倍或4倍以上升高。可以看出分子检测（病毒核酸，此处流感病毒为RNA病毒）已经被临床所认可。对于病原体检测来说，
7、传统的培养方法难以解决病毒，结核杆菌的问题。而免疫学检测也存在反应的“窗口期”。PCR检测正好提供了无限的可能。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。并且通过PCR技术可以对病毒进行分型，检出细菌的耐药基因。最近，多重PCR技术（能在一个样品中检测大量目标）的有效使用带来了全新的检测概念“Syndromic Approach/症候群处置“。这种诊断方式从患者的症状出发，设计病原物检测的组合，进一步改变了需要一系列单独实验来检测不同病原体的模式，一个样品、一次检测就能对某种感染症状/症候群做出基本的诊断。多重PCR(multiplex PCR)，是在同一PCR反应管中同时加上多种
8、病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。多重PCR十分适合针对一个样本，同时检测与某种特殊感染性综合症（如脓毒病、脑膜炎/脑炎以及尿道、呼吸道或胃肠道感染）最常相关的一组病原体。现在的多重PCR大多集中在35种靶标的检测，例如流感病毒（分型或不分型）和RSV（呼吸道合胞病毒）的检测目前在FDA就已有数种产品获批。但这些产品检测的病原体数目较少，难以满足临床的要求。随着技术的发展，梅里埃公司的FilmArray产品超过10种靶点的产品获批，能够通过一次检测，基本涵盖呼吸道感染，腹泻，血流感染，脑膜炎等症候群相关的病原体。多重PCR技术具有以下特
9、点:高效性 当临床样本难以获得或样本量有限（例如脑脊液），或当多种不同病原体能导致相同临床表现且临床医师难以判断致病菌时（如呼吸道感染），多重PCR具有更高效率。灵敏度和准确性多重PCR能够提高病原体的检出率，并且可以同时检出多重病原体共感染。Matthew等在2015年Medicine中报道，284名患者中，29.6%的患者存在多种病原体的共感染。经济性 多种病原体在同一反应体系中同时检出，将大大的节省时间，简化操作，为临床提供更多更准确的诊断信息。梅里埃公司的FilmArray产品能够在一个小时左右时间内提供至多20种靶标的结果。随着分子技术的不断发展，在呼吸道病原体检测中，PCR尤其是多
10、重PCR将有着广泛的应用前景。梅里埃FilmArray快速病原体检测解决方案介绍梅里埃公司和Biofire公司梅里埃公司创建于1963年，公司依赖自身的科技研究和工业生产资源，始终致力于开发作为医疗和工业用途的体外诊断产品，是体外诊断领域全球排名前十的生产商。 集团不断设计、开发、生产和推广应用在临床和工业的系统，同时通过一个又一个成功的并购强大自身。梅里埃的诊断产品主要用于传染病、心血管病、肿瘤病和食品药品微生物四个主要领域的诊断。目前集团共有19个生产基地、17个研究中心以及42个办事处，分布于欧洲、北美洲、亚洲和南美洲。在2014年，梅里埃诊断产品总销售额为16.98亿欧元，公司员工超过
11、9000人。梅里埃公司对中国的卫生事业的发展有着巨大的推动作用作用。2014年习近平主席在访问法国期间，特意莅临梅里埃集团的研发中心，表示了中国对于梅里埃家族对中国卫生事业发展的感谢。梅里埃公司于2013年斥资4.5亿美金收购了美国Biofire公司。Biofire公司是世界知名的分子诊断产品供应商，最早进入中国市场的实时荧光定量PCR仪器LightCycler所采用的即是Biofire公司（前身Idaho Technology）的专利技术。Biofire公司自建立之后，在原有技术上精益求精，不断开发新的技术和产品，在2012年推出了具有划时代意义的多重病原体快速诊断系统FilmArray以及
12、呼吸道感染检测试剂盒，并获得了FDA的认证。随后相继推出了胃肠道感染检测、血流感染检测、埃博拉检测以及脑膜炎/脑炎检测试剂盒，用于快速准确鉴定病毒、细菌和寄生虫等病原体。同时仍在研发新的仪器和产品，以更好的满足市场的需求。目前FilmArray系统在世界范围内已经取得了成功，截止到2015年上半年，全球装机量超过1900台。FilmArray 2.0已于2016年9月成功获得中国食品药品监督总局（CFDA）注册证。FilmArray产品及原理介绍FilmArray系统是基于多重巢式PCR技术的快速病原体分子诊断产品，可以在1小时内完成超过20种病原体的快速检测。一套完整的FilmArray检测
13、系统由仪器、配套试剂和软件组成。FilmArray仪器：FilmArray仪器体积小巧，虽然只有普通PCR仪器一般的大小（25.4 x 39.3 x 16.5cm），但是却能够完成更多的实验功能：从标本直接进行核酸提取、纯化、巢式PCR以及高分辨率熔解曲线结果判读。可以说，FilmArray一台仪器完成了过去划分成三个区域的标准分子生物学实验室的所有工作，而且整个过程都是自动化完成，真正实现了“标本进、结果出”的检测模式。最值得称道的是，所有的实验步骤在仪器内只需要65分钟时间就可以完成；同传统的核酸提取加上PCR、实时定量PCR、杂交或其他方法相比，大大提高了实验效率，从繁杂的实验中解放了实
14、验室的工作人员。与此同时，这套全封闭的FilmArray仪器，对于工作人员的操作安全提供了最大程度的保证。最新版本的FilmArray2.0系统可以通过一台电脑同时连接8台仪器，在减少单个标本检测时间的同时提高检测通量。FilmArray试剂：FilmArray系统独特设计的另一个体现就是采用了微流控技术高度集成化的测试条。如图中所示，FilmArray使用的测试条不同于市面上其他产品，是一种整合了磁珠, 反应试剂以及反应腔的一体化产品；也正是由于这些看上去不那么简单的设计，才能够保证待测标本的核酸提取、纯化、扩增、检测依次精确完成。整体反应在密封的环境中, 保证了实验的生物安全性, 并大大降
15、低了结果污染的可能性；同时干粉状态的试剂可以在室温下长期保存，无须特殊储存条件。ABA图 全新测试条展示；B图 不同反应区域展示。新的测试条是没有图中所表示的这些颜色，这些标识的颜色用来说明测试条之中不同的反应区域及其功能。FilmArray测试条是由塑料薄膜包被的不同反应区域构成的，每个反应区域配合测试条自带的试剂，依次完成核酸提取、纯化、扩增、检测等工作；同时凭借着巧妙地设计，可以保证反应液体在不同区域之间流动以完成整个实验。1） 临床标本的上样：将测试条放入样品加载平台。来自病人的临床标本（呼吸道感染检测为鼻咽拭子标本）经过简单的洗脱之后，从样本端口被注射入测试条内。同时从测试条另一端的
16、缓冲液端口加入溶解缓冲液以溶解测试条内干粉状态的反应试剂。随后将测试条放入仪器进行测试。整个测试条准备过程十分简单，只需要分钟的时间。2） 核酸提取：注入测试条的标本，同核酸提取区内的瓷珠混合，在仪器中通过不断地搅动以破碎细胞，释放核酸（DNA+RNA）。3） 核酸纯化：上一步中破碎后的样本进入核酸纯化区域，同可以结合核酸的磁珠结合，经过洗脱、溶解之后完成核酸纯化过程。4） 反转录及第一阶段PCR：经过纯化的DNA和RNA进入到第一阶段PCR反应区域。首先经过一个快速的反转录过程, 将RNA转变成为cDNA，之后开始进行第一阶段的多重PCR反应。 第一阶段PCR反应涉及到了超过50种引物,扩增较长的DNA片段。5） 第二阶段PCR及熔解曲线检测，第
