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1、第10章 核酸的生物合成,为什么子女与父母非常相象？,生物所以有遗传现象，是与遗传物质DNA的复制有关系的。,中心法则(central dogma) DNA RNA 蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,几个基本概念：,逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。,转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互
2、补的RNA的过程。,第1节 DNA的生物合成,三个方面： 1.复制 2.损伤修复 3.逆转录,一、参与DNA复制的酶及蛋白因子,DNA链合成的条件： dNTP Mg+ 引物 DNA模板 酶和蛋白质因子,三种大肠杆菌DNA聚合酶 1. DNA聚合酶I 3 5外切酶； 5 3聚合酶 5 3外切酶 作用：切除引物、填补空缺、损伤修复,Klenow片段,（一） DNA聚合酶（DNA polymerase）,枯草杆菌蛋白酶,68 kDa,35 kDa,大肠杆菌DNA聚合酶（修复酶）,Large（Klenow）fragment of DNA pol ,2. DNA聚合酶 3 5外切酶 5 3聚合酶 作用：
3、DNA损伤修复 3. DNA聚合酶III 大肠杆菌DNA复制的主要酶,Sliding clamp subunits,聚合酶活性,聚合酶活性,3 5 外切活性, 复合物， 促进亚基二聚体转移 并结合于DNA双螺旋,DNA pol III （复制酶）,促进核心酶 形成二聚体,组装,防止核心酶从模板DNA上滑落,所有DNA聚合酶都只能在模板链的指令下，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，没有从头合成活力； 引物酶合成一小段RNA，作为DNA合成的引物； 必须与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物的活性。 如：DonaB、DonaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等,（二）引物酶
4、和引发体,（三）DNA连接酶（DNA ligase),3,5 磷酸二酯键的形成 哺乳动物：ATP供能， 大肠杆菌：NAD供能， 都需要Mg2+ 在DNA复制、重组及损伤修复中起作用,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,3 OH,5,5,3,O O- P O O-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,O O P O O-,5,3,缺口封闭,（四）解螺旋酶,催化DNA双螺旋解链； 需ATP供能。,（五）单链结合蛋白（SSB）,与解开的单链结合，防止形成双螺旋； 防止核酸酶的降解；,（六）拓扑异构酶,拓扑异构酶：解除超螺旋,二、DNA的复制,半保留复制方式,Old st
5、rand,New strand,The hypothesis of semiconservative replication proposed by Watson and Crick in 1953.,大肠杆菌培养在15N培养基中,转到14N培养基中，第一代 （50分钟左右）,第二代,DNA复制合成的子代DNA分子中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以称为半保留复制。,二、DNA的复制过程,起始、延伸、终止,(2)模板DNA解除高级结构 解螺旋酶把双螺旋解开成单链，SSB立即结合单链。拓扑异构酶解开复制叉前方的超缠现象。 （3）RNA引物的形成 由引发酶以单链DNA为模板，按53合
6、成引物。,1.起始 （1）辨认起始点 DNA复制有固定的起始点（富含AT） 。,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解旋酶,拓扑异构酶,原核生物 双向复制 （型复制） 特定起始点：oriC,真核生物 多个复制单位（复制泡） （复制起始点+复制叉） 多个起始点,复制的方向,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,DNA的起点和方式,基因组能独立进行
7、复制的单位称为复制子。每个复制子都含有控制复制起始的起点（origin），可能还含有终止复制的终点（terminus）。,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,在RNA引物上，由DNA聚合酶催化，在引物3-OH每掺入一个核苷酸，从底物dNTP切下一个焦磷酸。 体内仅存在5 3的DNA聚合酶,2.延伸,在RNA引物上，由DNA聚合酶催化， 体内仅存在5 3的DNA聚
8、合酶,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,前导链（leading strand）： DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致）,滞后链（lagging strand): DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为滞后链。 （复制方向与解链方向相反),冈崎片段（Okazaki）,岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链,DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5
9、3方向合成许多不连续的片段（冈崎片段） 这种复制方式称之为半不连续复制。,去除RNA引物 补充空缺 连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶 DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶 DNA连接酶,3.终止,当复制叉到分子末端，复制即终止。,严格的碱基配对规律 聚合酶的选择作用 复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能 DNA损伤的修复,三、保证高保真度复制的机制,四、逆转录作用,以RNA为模板合成DNA的过程。 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）。,逆转录酶性质,催化三种反应： RNA指导的DNA合成 RNA水解 DNA指导的DNA合成,病毒 RNA,RNA DNA(-),DNA
10、(-),DNA(-) DNA(+),1.RNA指导DNA合成,2.RNA水解,3.DNA指导DNA合成,逆转录酶的作用,自发因素 物理因素 化学因素,紫外线损伤 电离辐射损伤（X线/线） 亚硝酸盐 C U 5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂 羟胺 C- A,G,G,羟胺,1.造成损伤的原因,五、DNA的损伤、修复与突变,2. DNA损伤修复,光修复 切除修复 重组修复,光复活/光修复 光复活酶识别TT 与之形成复合物 吸收光能 使TT解开成为单体 酶从复合物中释放 仅作用于UV形成的产物,切除修复发生在复制之前,限制性内切酶： 主要降解外源DNA 具有严格的碱基序列专一性 EcoR 第
11、一个字母为大肠杆菌E.coli属名； co为种名的头两个字母； 第四个字母R表示大肠杆菌的菌株； 最后一个罗马数字表示该细菌中已分离出的这一类酶的编号。,3、DNA突变,第2节 RNA的生物合成,基因转录:以DNA为模板的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对原则，以四种NTP为原料，合成一条与DNA互补的RNA链的过程。 不对称转录:DNA双链中一条链的某一区段作为模板合成RNA，而另一条链不用于合成RNA。 转录起始于DNA模板的一个特定位点（启动子），并在一定位点终止（终止子），这个转录区域称为转录单位。,在转录中，双股DNA中只有一条链是模板（模板链）（反意义链） （-链） 另一条链为（编
12、码链）（有意义链） （+链）,一、催化RNA合成的酶,1. 大肠杆菌RNA聚合酶 全酶= 2 核心酶= 2 识别转录起始信号。 参与酶与底物的结合，以及与因子和核心 酶的结合。 参与因子和核心酶的结合，并参与RNA合成的引发、延伸。 与模板的结合、酶的滑动以及碱基识别有关。,大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图,核心酶(2),起始因子, 和模板DNA结合 起始和催化聚合反应 酶的装配、结合启动子等,全酶(2 ),2. 真核细胞RNA聚合酶 在DEAE-Sephadex柱上的洗脱次序称为酶、II、 ，基于对鹅膏蕈碱的敏感程度称为酶A、B、C,二、转录的过程,起始 延伸 终止,1.转录起始,启动子：R
13、NA聚合酶全酶识别、结合、开始转录的DNA序列（双链）,原核生物启动子的特点: (1)DNA序列在转录起始点的5端区(上游区)(2)-10bp处 -TATAAT- (Pribnow box)(3)-35bp处 -TTGACA- (识别区),原核生物的转录起始,亚基辨认-35区,RNA pol 全酶移向-10区,合成第一个磷酸二酯键,5-GpN-3,转录起始复合物,RNA pol( ) DNApppGpN-OH,亚基脱落,（结合松弛）,（结合紧密）,转录起始不需引物！,16/50,以NTP为原料和能量,DNA模板链为模形成核糖核酸链(RNA),当几个核苷三磷酸掺入后， 亚基就会被释放脱离核心酶。
14、,2.链的延伸,3. 转录终止,终止子（terminator） 提供转录终止信号的DNA序列 终止因子（termination factor） 协助RNA Pol识别终止信号的辅助因子,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子Promoter,终止子terminator,1.rRNA 的转录后加工 rRNA基因转录原初产物 原核生物：30S 哺乳动物：45S,RNase,三、RNA转录后加工,The 18S, 5.8S, and 28S rRNAs in eukaryotic cells are derived from one pre-
15、rRNA molecule (the processing needs small nucleolar RNA-containing proteins).,2.tRNA的转录后加工,碱基修饰 3端 5端,稀有碱基- T 脱氨 - AMP IMP 还原 - DHU 甲基化- mA mG CCA-OH RNaseP切除多余的核苷酸,真核与原核生物mRNA的区别,原核生物mRNA 多顺反子 转录与翻译同步 mRNA不需加工 寿命短,真核生物mRNA 单顺反子 转录后需加工运至 胞浆再翻译 mRNA需加工 寿命较长,3.mRNA的加工与成熟,加帽 加尾 mRNA前体的剪接,5端：m7GpppGpN 作用:稳定mRNA 5端 和翻译的起始有关 3端: polyA尾巴 作用：稳定mRNA 和翻译模板活性有关 剪除内含子，连接外显子,加工过程主要包括：,DNA复制与转录的比较,相同点,模板 两股链均复制 模板链转录 合成方式 半保留复制 不对称转录 原 料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 碱基配对 A-T，G-C A-U，T-A，G-C 产物 半保留的双链DNA 单链RNA 引物 需要 不需要,不同点,以DNA为模板 遵循碱基配对原则 都需依赖DNA的聚
