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1、实验六 小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定,实验目的,掌握小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活力测定的原理和方法,酶活力： 在最适反应条件（25）下，每分钟内催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1U=1mol/min。 酶的比活力： 代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。 比活力=活力（U）/蛋白（mg）=总活力（U）/总蛋白（mg） 酶活力的测定方法： 分光光度法；荧光法；同位素测定法；电化学法,基本知识,蛋白质（酶）的分离纯化,根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等。 性 质 方 法 分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉
2、淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 电泳、离子交换层析 吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水层析） 配体分子 亲和层析的生物亲和力,1、粗分级分离,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,（1）盐析,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(NH4)2SO4，Na2SO4，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白
3、质分子表面的水化层。,分段盐析,不同蛋白分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不同，因此调节盐浓度，可使不同的蛋白质分别沉淀，如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,完全饱和,析出,析出,常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。,透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在具半透膜（玻璃纸、火绵纸等）性质的透析袋里，放在蒸馏水中进行透析，可不断更换蒸馏水直至杂质被除去。,透析袋,蛋白质溶液,蒸馏水,蛋白质用盐析方
4、法沉淀分离后，还需要脱盐来进一步提纯。脱盐常用透析法。,（2）等电点沉淀,蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。,（3）有机溶剂法,与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。原因？ 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 常温下，有机溶剂不仅
5、能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。,2、细分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。 常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。 常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。 另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,3、酶的活力测定,在酶的制备过程中，每一步骤都应测定酶的总活力和
6、比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。 总活力=活力单位 / ml 酶液总体积（ml） 比活力=总活力单位数 / 总蛋白（mg） 纯化倍数=每次比活力 / 第一次比活力 回收率（产率）=（每次总活力 / 第一次总活力）100%,实验原理,小牛肠碱性磷酸酶分子量为145000，等电点为5.7。在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸收值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。,实验器材： 新鲜小牛肠、匀浆机、离心管、剪刀、载玻片、离心机、滤布、762型分光光度计。 试剂： 正丁醇、丙酮（-20预冷），1mol/L
7、 HAc，1mol/L NaOH，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠。 平衡缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0），含1.010-3mol/L MgCl2和1.010-5mol/L ZnCl2。 底物缓冲液：1mol/L 二已醇胺-盐酸缓冲液（pH9.8），含0.510-3mol/L MgCl2。 酶的底物溶液：用底物缓冲液配制1510-3mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。,实验步骤,1、取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮小肠粘膜到烧杯里。 2、所有组都倒入匀浆机里，加1.5倍体积冷蒸馏水，搅拌均匀，高速匀浆三次，量总体积。取出2ml测酶活和蛋白质的含量。 3、取适量匀浆液加入
8、1倍体积正丁醇，搅拌，于100ml离心管，在4下，10000rpm离心10min。(离心前一定注意配平) 4、用分液漏斗取下层水相，用滤布过滤出除杂质，用1mol/L HAc调pH到 4.9，10000rpm 离心 10min，除沉淀。,5、上清用1mol/L NaOH 调pH至6.5，称硫酸铵至5%，加入离心管，加0.47倍体积冰冷丙酮，混匀， 4放置30min以上。 6、4，8000rpm 离心10min，除沉淀，上清（测酶活）加入 1.07倍体积冷丙酮，4放置30min以上。 7、4，8000rpm 离心10min，其上清，将沉淀溶于2ml平衡缓冲液，（向溶液中加入硫酸铵至35%，混匀，
9、4，8000rpm 离心10min，除沉淀。 8、上清加入硫酸铵至65%混匀，4，8000rpm 离心10min，沉淀溶于2ml平衡缓冲液。）,9、将称量溶解好的酶的底物（对硝基苯磷酸二钠）37保温5min，取底物1.5ml加入玻璃比色杯（小型）中，加入1050l酶样品液，立即在405nm波长下，按Start键，设定120秒，画出酶动力学曲线。其中的酶样品液要测量蛋白质浓度，计算比酶活力单位。 酶活力（U/mg）=（ A/t）VRD/E405VEc A：405nm波长下吸光度的变化 t：时间，min；VR：反应液的体积；D：稀释倍数；E405：405nm波长下对硝基苯酚的摩尔吸收系数，18.3
10、；VE：所加酶液体积；c：酶液浓度。 10、蛋白质的测定： 将酶样稀释1025倍，取0.1ml，加5ml考马斯亮蓝，在595nm波长下测吸光值，确定蛋白浓度。,1、小牛肠碱性磷酸酶的分子量是多少？等电点是多少？ 分子量为145000，等电点为5.7 2、何谓酶活力（单位）？ 在最适反应条件（25）下，每分钟内催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1U=1mol/min。 3、何谓盐析？盐溶？ 蛋白质溶液中加入大量的中性盐(NH4)2SO4，Na2SO4， 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 蛋白质溶液中加入少量的中性盐(NH4)2SO4，Na2SO4，会增加蛋白
11、质与水分子的作用，从而使蛋白质在水中的溶解度增大，这种现象称为盐溶。,思考题,4、与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，为什么？ 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 5、为什么先将有机溶剂冷却，然后边搅拌边逐渐加入到蛋白质溶液中？ 常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题。 6、本实验中正丁醇的作用是什么？ 小牛肠碱性磷酸酶为膜结合酶，具有典型的两亲性质，其疏水端锚定在微绒毛膜上。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。,结 束 ！,
