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1、主要内容 组织培养实验仪器设备及使用方法 无菌操作技术 培养基的制备方法和步骤 外植体的灭菌方法 褐变和玻璃化原因及应对措施,2 植物细胞组织培养的基本技术,第一节植物组织培养实验室及主要设备,实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。 实验室的大小应取决于工作的目的和规模 按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱 利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件,一、实验室设计与设备,基本设备,1.准备室：根据实验操作的性质，进行适当的分区 清洗区 培养基配制区 试剂存放区 灭菌区,准备室主要仪器设备：,工作台 药品柜 冰箱 普通冰箱、低温冰箱等。主
2、要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。 天平 感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为0.1g的托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等） 放置在水平、干燥、不受震动的操作台上,(5)恒温水浴锅 (6)蒸馏水发生器 蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水） (7)电炉 (8)高压灭菌锅 进行培养基、水和器械用具的灭菌,(9)酸度计 测定培养基及酶制剂的pH值（普通实验可使用pH试纸） (10)烘箱 干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌 和测定干物重 (11)摇床 振荡培养 (12)离心
3、机 分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体,PHS-802中文台式酸度计,通用型或经济型酸度计,全温型恒温培养摇床,多振幅高速轨道摇床,不锈钢蒸馏水器（单蒸水）,、缓冲室（注意门的朝向）,工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩 功能 减少人体从外界带入的尘埃等污染物。 要求 缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌； 有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服； 1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。,基本设备,3.无菌操作室（区） 主要用于植物材料的消毒、接种等 是植物组织培养研究中最关键的部分 分区： 准备室 接种室：定期消毒，甲醛和高锰酸钾蒸汽 熏蒸 目前，大多数实验室采用超净工作台
4、代替,基本设备,3.培养室,基本设备,4.用具 培养瓶,广口瓶,三角瓶,量筒,烧杯,容量瓶,移液管,培养皿,试管,镊子,解剖针,接种针,剪刀,用具的洗涤： 1.玻璃器皿的消毒 1）新购置，用1%稀HCL浸泡一夜，肥皂水洗净，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍 2）用过，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，干后备用 3）已污染，高压蒸汽灭菌30min 2.金属器皿的消毒 擦净油腻，热肥皂水洗净，清水冲洗，擦干备用,用具的灭菌 高温灭菌：干热灭菌 高压蒸汽灭菌,、培养室,功能 接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。 要求： 能控制光照和温度 保持相对的无菌环境 有排风窗和换气扇等培养室
5、的换气装置 有适宜的培养架，日光灯照明。 主要设备 培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。,小型臭氧发生器,二、培养器皿及用具,1、培养器皿（包括玻璃器皿和塑料器皿） 各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。 2、微孔过滤器（细菌过滤器） 0.45微米，抽滤灭菌用，如激素 3、器械用具 镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。,第二节培养基及其配制,定义： 培养基(culture medium)根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。是植物组织培养的重要基质。 不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 没有一种培养
6、基能够适合一切类型的植物组织或器官 找到一合适的培养基，是培养成功的基础。,一培养基成分,主要为： 水 无机盐 有机化合物 生长调节物质,水,水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。 培养基大部分是水（固体培养基 约7580%） 天然水或自来水不能直接用于培养基配制 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水。 大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。,保持母液及培养基成分的精确性 防止贮藏过程发霉变质,无机盐类(inorganic element）,离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为： 大量元素 微量
7、元素,大量元素 指植物所需元素的浓度大于0.5mmolL的元素，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。 除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收 N有硝态氮KNO3和铵态氮(NH4)2SO4两种形式（一般NH4N对植物生长较为有利）。,微量元素,浓度小于0.5mmolL的元素，有 Fe、Cu、Zn等。 铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。,3.有机化合物(organic compound) 基本培养基（只含有大量和微量元素） 为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸
8、等 （）糖类（碳水化合物 ） 碳源，维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖。 不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。 细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖,（）维生素 明显的促进离体培养物的生长。 盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸、生物素、抗坏血酸-Vc等。 一般用量为0.11.0mgL。 （）肌醇（环己六醇） 促进胚状体和芽的形成。用量一般50-100mg/L。 （）氨基酸 常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白） 用量在10-1000mgL之间。 （营养丰富，极易引起污染，如在
9、培养中无特别需要，以不用为宜。）,（） 天然复合物（包括部分蛋白质水解物） 其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。 成分大多不清楚，一般尽量避免使用。,、生长调节物质（植物激素）,植物激素（hormone）是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等多种生理生化活动，是培养基的关键物质。 主要包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素,生长素0.05-5mgL 细胞分裂素0.0510mgL。,（）生长素类(auxi
10、n),生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞脱分化，诱导根的分化和促进细胞伸长生长。 天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质 常用IAA、IBA、NAA、2,4-D 配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中,IAA-天然生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，受光也易分解 NAA-启动能力比IAA高出3-4倍，可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，应用较普遍 IBA-促进发根能力较强 NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。
11、 2，4D -启动能力比IAA高10倍，特别是促进愈伤组织的形成，同时强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应,腺嘌吟的衍生物，包括6-BA、Kt、Zt 等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。 作用： 诱导芽的分化 促进侧芽萌发生长 促进细胞分裂与扩大（茎增粗），抑制根的分化，延缓衰老 多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。,（）细胞分裂素类(cytokinin，CTK),（）赤霉素（gibberellic acid）,有20多种，培养基中添加的是GA3，一般极少使用 作用 促进幼苗茎的伸长生长 促进胚发育成小植株； 离体培养下，还与生长素协调作用对形成
12、层分化有影响 当生长素赤霉素比值高，木质部分化，比值低，韧皮部分化。 打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。 在器官形成后，添加赤霉素有时可促进器官或胚状体的生长,激素配比模式,生长素/细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。,生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用。同时其在培养基中的绝对值也会影响外植体分化发育的方向。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The exp
13、lant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant,
14、along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No 6-BA,6-BA reduced to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,Mo
15、re balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of r
16、oots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,No MS salts No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,其它附加成分,（）琼脂(agar) 是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量6-10gL ，不是培
