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1、有关物质的HPLC方法建立,有关物质,有关物质: 特定物质中不是主要组成物，但与成份相关的物质。,有关物质的来源,原料药合成过程中带入; 制剂过程中产生; 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。,杂质对照品法 加响应因子（即重量校正因子）计算的自身 对照法、 不加响应因子计算的自身对照法 根据不同杂质采用不同方法等。 有关物质的计算方法 定量检测和限度检测,有关物质的计算方法,溶解度考察,考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。,紫外光谱绘制,考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时
2、的检测波长。几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。,流动相的选择,中性成分 被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。 被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。,碱性成分 向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。 加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对试剂使
3、保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。流动相的pH一般为3-5。,酸性成分 向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。适用于分离3pKa7的弱酸。 加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的pH一般为7-7.5。,流动相的要求,被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。主成分保留时间以10分钟为宜。分析时间通常为主成分保留时间的2-3倍。分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。,检测波长的确定,以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。综合以上考察结果，将检测波长作修正。,涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否
4、相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。 目前国外有关该项研究的进展,供试品溶液浓度的选择,配制一系列不同浓度的溶液，在不过载的前提下确定浓度的增加不再引起杂质增加的拐点浓度。 配制已知原料、中间体、杂质等的稀溶液，确定其检测限与定量限。通常以0.1%计，反推得供试品溶液的最低浓度。 综合以上考察结果，以柱效最优作考量，确定供试
5、品溶液的浓度。,杂质限度的确定,药品注册的国际技术要求对于含量大于0.1%的杂质应确证结构。 现在认为尽管定量结构活性关系程序可以用于推测单个杂质或给定杂质谱的毒性，但结果通常不认为对确认目的是决定性的。,方法学验证,准确度 对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别配制该杂质浓度为0.1、0.2和0.3的杂质溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于
6、10%。,线性 适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100响应值的25以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。,精密度 适用与有定量要求的杂质检查。 重复性 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。 中间精密度 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人
7、员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。,专属性 空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。,破坏试验 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90放置24小时。 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90放置24小时。 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90放置24小时。 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变。 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。,检测限与定量限 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 杂质峰与噪
8、音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。,耐用性 分别考察流动相比例变化5、流动相pH值变化0.2、柱温变化5、检测波长变化5nm、流速相对值变化20以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在0.1以内。,系统适应性 适用与有定量要求的杂质检查。 配制6份相同浓度的杂质溶液
9、进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。,溶液稳定性 按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。 可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在0.1以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。根据统计数据确定供试品溶液的保存条件及效期。,HPLC测定AOMT有关物质,杂质 A,杂质 B,杂质 C,杂质 D
10、,杂质 E,检测波长的选择,AOMT与其相关物质的紫外光谱图,流动相选择,乙腈直接影响AOMT与杂质C的分离，乙腈比例增加，AOMT出峰加快，但与杂质C的分离度下降，选择乙腈-磷酸盐缓冲液（PH3.0）40：60条件下等度洗脱，杂质E出峰时间较晚，同时杂质E峰展宽，降低了灵敏度，采用梯度洗脱，减少分析时间，增加灵敏度。,溶剂的选择,选择80%乙腈水作为溶剂是因为AOMT是水溶性化合物，在乙腈中不溶，但在水和甲醇中易水解。,色谱条件,色谱柱：C18 （4.6mm 250mm,5m）； 流动相：A:乙腈-B:磷酸盐缓冲液（1.36g 磷酸二氢钾，加入1000ml水溶解，加入2ml三乙胺，用磷酸调节
11、PH为3.0） 检测波长：240n； 流速：1.0ml/min 测定法：取本品适量加80%乙腈水溶液溶解并稀释至1.0mg/ml，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；,专属性试验,AOMT与其相关物质分离色谱图,1，杂质 A；2，杂质 B；3，AOMT；4，杂质C；4，杂质D；5，杂质D,杂质B与AOMT分离度5.0，AOMT与杂质C分离度2.9.,线性与检测限,精密度，回收率，稳定性试验,精密度： AOMT、杂质A、B、C、D、E 的 RSD分别为0.8%，1.8 % ，0.9 % ，1.4 % ，1.5 % ，1.1 %. 回收率： A、B、C、D、E 的 平均回收率分别为101.2%，98.9%，99.4%，100.6%，97.9%；RSD分别为2.5%，1.2% ，1.4% ，0.9 % ，1.3%. 稳定性： A、B、C、D、E 的 RSD分别为3.1%，1.2% ，1.4% ，0.9 % ，1.3%.,样品测定,不同方法计算AOMT中相关物质的含量,注：f（A，B，C，D，E)为0.90，0.88，1.07，1.04，1.13.,药品注册的国际技术要求中提出校正因子超出0.9-1.1，自身对照法不能反应杂质的真实含量；故加校正因子自身对照法和杂质外标法更能体现样品的真实情况。,
