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1、普通光学显微镜原理与使用,河北大学细胞生物学实验室,主要内容,显微镜的发展 显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念 显微镜的结构 显微镜的使用 显微镜的维护,要知道的几个重要的分辨率,人眼：0.2mm/250mm 光学显微镜：0.2um 电子显微镜：0.2nm,1.显微镜的发展,1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 人眼视锥细胞直径为4微米，对应的视角约为30秒，这个角度就是视角的极限。一般要能清晰
2、的分辨两个点，视角须在1分以上。高1米的物体距眼睛3400米时，视角为1分。,1.2 放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x 1.3 显微镜： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，,罗伯特虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍,列文虎克和他的显微镜（约1680）,2 显微镜的光学原理,2
3、.1折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。,2.2凸透镜的五种成象规律(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； (2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； (3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； (4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象； (5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置
4、形成放大的直立虚象。,2.3显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。 AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。,3 显微镜的几个基本概念,3.1 光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中对应的波长
5、范围：390nm 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红,3.2分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin D：分辨率 :光波的波长 N:介质折射率 :物镜镜口角 3.3孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角称为孔径角。 3.4数值孔径：令NA = nsin , 叫物镜的数值孔径。 数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率越高。,物镜数值孔径,3.5放大率 在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物
6、镜、镜筒长度、目镜所决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的5001000倍。 3.6像差,像差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,色差,球差校正,色差校正,3.7焦点深度 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。,焦点深度,3.8视场数 目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。 在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜
7、的某些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值,3.9工作距离 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。,s1,s2,D,*,*,爱里斑,瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。,提高显微镜分辨率的方法：,（1）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以n 较大的
8、油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角 也增大。 （2）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。,4 显微镜的结构,组成,光学放大系统,照明系统,机械和支架系统,物镜,光源,折光镜,聚光镜,滤光片,目镜,光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob)
9、 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.),4.1物镜 物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。 (1)消色差物镜(achromat) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。 (2)复消色差物镜(apochromat) 是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。,(3)平象物镜 它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发
10、生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字样。 (4)相差物镜 相差物镜(Phasencontrast objective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。有关位相板涂料的性质和作用原理在以后详述。 外壳上刻有Ph标记,物镜结构,低倍物镜,物镜标识,无限远光学系统,4.2目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并
11、把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。 4.3聚光镜 聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。,聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整
12、亮度。,聚光器数值孔径,5 光学显微镜的使用,实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm左右。 打开光源开关，调节光强到合适大小。 转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。 将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。 先用低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。需要注意，不能使物镜触及玻片，然后，通过目镜观察，并转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看清物像。,如果像偏离视野，可慢慢调节载物台移动手柄。 瞳距调节：左右推拉目镜，使两目镜距离与自己两眼距离相等。 屈光度调节 高倍物镜观察：把物
13、像中需要放大观察的部分移至视野中央。将高倍物镜转入光路（一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰），微动调焦手轮进行调节。 根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。 观察完毕，应先将物镜镜头从通光孔处移开，并检查物镜是否沾水沾油，检查处理完毕后即可装箱。,瞳距调节,屈光度调节,6 光学显微镜的维护,显微镜要轻拿轻放。 严禁将表面有水的载片放到显微镜上。 从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍另行调节、查找原因。 每次
14、使用完毕后将将光源亮度调至最低。 临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需关闭。忌频繁开关显微镜电源。 镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。 使用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或放入箱内，并存于干燥无尘处。,清洁工具,清洁液配方：1份无水乙醇3份乙醚,擦拭方法,注意,塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。 严禁用干擦镜纸擦拭镜头。 物镜严禁拆卸并防止振动。 打开电源前应,思考题,在使用高倍镜时，如果把标本片放反了，将会出观什么问题？为什么？ 在低倍镜调节焦距时。当视野中出现了能随标本片移动而移动的颗粒或斑纹。是否只要调节推进器将标本对准物镜中央，就一定能观察到标本的物像?为什么? 高倍镜呢？ 你如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上? 使用显微镜观察标本为什么定要从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行? 在低倍镜下已看到物像。在转换高倍镜时却直接转换不过来，试分析可能有哪些原因?,
