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1、环工综合实验 细菌的分离纯化和接种实验 实验报告 环境科学与工程学院实验中心环境科学与工程学院实验中心 实验题目细菌的分离纯化和接种实验实验类别综合 实 验 室实 验 时 间 实验环境温度:湿度:同组人数 一、 实验目的 1.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术； 2.了解不同的微生物菌落在斜面上、固体培养基中的生长特征； 3.进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术； 4.掌握微生物培养方法。 二、 实验仪器及设备 仪器：无菌小试管 8 支、盛无菌水的锥形瓶 1 个、盛无菌基础培养基的锥形瓶 1 个、 无菌玻璃涂棒、 5mL 无菌移液管 1 支、 1mL 无菌移液管 4 支、
2、接种环、 煤气灯、无菌培养皿 10 套 试剂：无菌水、无菌基础培养基、未知菌种、酵母菌、羽毛溶解菌、湖水 三、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生 物的分离与纯化。 常用的分离、纯化方法 ： 单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法， 平板划线法。 稀释涂布平板法步骤 ： 倒平板 （标记培养基名称） 制备湖水稀释液 涂布培养（平板倒置）挑菌落；平板划线法步骤：倒平板（标记培养基名 称）制备湖水稀释液划线培养（平板倒置）挑菌落。 培养斜面：试管中加培养液（标记培养基名称）斜放试管制斜面选取 菌种划线培养（试管倾斜）挑菌落。 实验原理问答题： 1.为什么湖
3、水用 104、105 、106稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更 低的浓度？ 答 ： 因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/ 细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。 2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养? 答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水 分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察 ； 第三，防止培养基干涸。 3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？ 答：划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射 接种，活体接种等。 接种用具及培养基
4、等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种 环、 玻璃涂棒等器具要过火处理， 把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置， 操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触， 往培养基是划线或 点菌时动作要轻以防把培养基划破等。 四、实验步骤 1.制备细菌稀释液： 使用 5ml 移液管加 4.5ml 无菌水放入贴有 10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中， 用一根 1ml 的无菌移液管吸取 10-2的湖水稀释液 0.5ml 放入贴有 10-3标签的小试 管中，1ml 的无菌移液管吸洗三次以混匀。然后用另外一支 1ml 的无菌移液管从 贴有 10-3标签的小试管中吸取 10
5、-3的湖水稀释液 0.5ml 放入贴 10-4标签的小试管 中，吸洗三次以混匀。同法依次连续稀释至 10-5、10-6稀释液。 2.做平板（10 个）： 一人持盛培养基的锥形瓶置火焰旁边，将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰； 另一人拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml，加盖 后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝 后即为平板。 剩余培养基倒入 4 个无菌小试管中（每个小试管盛装约 1/4 体积培养液） ，试管 倾斜放置，做成斜面。 3、湖水中微生物含量的测定： 分别从 10-4、10-5、10-6土壤稀释液中，用各自润洗过的移液管吸取
6、0.2ml 的菌液 放在不同的平板上，摇晃并涂布均匀，平板平置在桌面，依法再做一组平行样。 4、空气、自来水中细菌含量的测定： 在一个平板中，加入 0.2ml 的自来水，摇晃并涂布均匀，并做一组平行样；打开 一平板盖，使培养基暴露在空气中 10 分钟，盖上皿盖。再做一组平行样。 5、微生物接种： 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再 从斜面上刮取少许菌苔取出， 接种环不能通过火焰， 应在火焰旁迅速插入接种管。 在试管中由下往上做 S 形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速 塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标 签或
7、用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。选择两个未知菌种、 一个酵母菌菌种、一个羽毛溶解菌菌种接种到斜面上。 6、培养： 斜面以及倒置后的平板全部放入恒温培养箱内 30培养。 五、实验注意事项 1.倒平板在培养基温度为 45 度以上进行。 2.微生物实验尽量保证实验环境在无菌状态 六、思考题 1.氧化亚铁硫杆菌（ Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微 生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。广 泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿 等酸性矿坑水 （pH4） 中最为常见。 其化能
8、自养， 专性好氧， 嗜酸， 革兰氏阴性， ， 主要利用利用 CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。请思考 其分离纯化的方法和步骤。 答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用 9K 或 Leathen 培养基反复分离纯化。 具体方法一：取菌液 10mL，加入盛有 100mL 灭菌 9K 或 Leathen 液体培养 基的 250mL 锥形瓶中，在 30,120r/min 的空气浴恒温摇床中培养，直至锥形瓶 中的溶液变为红棕色，一般需 4 天。反复几次。然后采用固体培养基稀释涂布平 板法分离纯化菌种以获得纯培养。在 9K 固体培养基上 710 天出现圆形凸起状 小菌落
9、（d1mm） ，将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种到装有 5mL 液体 培养基的小试管中，以棉球封口，培养条件同上，直到小试管的液体颜色也变成 红棕色。重复在液体培养基中扩大培养和在平板上反复分离，最后分离出优良菌 株。 具体方法二：取菌液 1mL，用 pH=2.5 的稀硫酸按每次稀释 10 倍，依次稀 释成 10-1， 10-2， 10-3， 10-4， 10-5， 10-6浓度的稀释液。 吸取稀释度为 10-4， 10-5， 10-6 稀释样各 0.2mL，分别接种到三个事先准备好的灭菌 9K 琼脂固体培养基，涂布 均匀，正置于 30恒温培养箱中静置培养，次日倒置继续培养，直至固体培养
10、基表面出现圆形凸起状小菌落（d1mm） ，一般需两周。将单独小菌落挑起，每 个小菌落分别接种到装有 5mL9K 液体培养基的小试管中， 以棉球封口， 放在 30 摇床中振荡培养，反复进行直到纯化为止。 2.某果园业主想知道其果园土壤中的微生物数量，请帮助设计方案（详细说明） 。 答：取一定重量的土壤，称取 1g，置于 100ml 无菌水中，振荡、离心，取上清 液得到土壤浸出液（看做土壤中的微生物全部转移至水中） 。对浸出液做梯度稀 释，取一定稀释度的溶液，在基础培养基上以平板涂布法培养后数菌落数，然后 乘上稀释倍数，就可得到 1g 土壤中该微生物的数量。 3.某生物实验室需要保存某菌种（白腐真菌） ，预计一年后需要再次接种使用， 请问，该菌种应该如何保存？ 答：液体石蜡保藏法（将灭菌液体石蜡注入已长好菌的斜面上隔绝空气，直立试 管低温保存）或滤纸保藏法（将灭菌滤纸浸满菌悬液，放入安瓿管真空干燥，熔 封保存）或冷冻真空干燥保藏法、斜面保藏法、穿刺保藏法、砂土管保藏法。
