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1、1、凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像,很漂亮, 用 CASP 软件分析后,其曲线呈典型的双峰,而正常细胞为单峰。我的一些 教训:观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则,凋亡细 胞中的 DNA 片断跑的太块,荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注:我用 的 是 中 性 条 件 , 20V, 200mA,20min, 凋 亡 细 胞 观 察 宜 选 用 10V,100mA,10min。朋友们如果有异议,请不吝赐教,也对我有所帮助。 2、 解旋 20 分钟应该没问题, 但是我认为您的电泳时间过长, 当然我不知道 您的电泳条件(电压、电流、 ) ,我认为 20 分钟足够了,
2、时间长了一是浪费 时间,二是彗星图像不好,不利于分析。您的裂解时间有点短了,文献报道, 最好不要少于 1.5 小时 3、一般 100ul0.5低熔点胶中含 400 个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像,感兴趣可以看看 ge=0 5、 注意, CASP只读.tif扩展名的图像, 如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式,就更好了,如果是.jpg 格式,那还要在计算机中转换一下,不过很简 单 6、首先,荧光染色的东西最好马上看,否则影响结果。 其次,您的染色液量我觉得多了点,我用 2ug/ml,1ml 注射器 1 滴就可以。 第三, 要忠于实验结果, 图象内容不能更改, 可以
3、用 ACDSEE 或 PHOTOSHOP 转换图象格式或大小,所以,作出来的实验图象质量要好 7、 。背景的选择问题,如果图片质量好的话,背景大小不同,对结果影 响不是很大,如果图片背景乱七八糟,那背景框的选择肯定对结果产生很大 影响。我的建议:背景框不要太大,参考我贴的那个图。注意,背景框可以 在细胞的上面或下面,如果背景框在上面时,分析后的图像(分析后出现一 个头、尾分明的图像,是基本重合在细胞上的)质量很差,很不规则,那再 把背景框调到下面试试,如果还是不好,那只能说你的结果质量不好了。背 景框的选择关键在于分析同一批细胞,背景框要相同,才能保持资料的可比 性。 结果的保存,记得好像使用
4、说明里提到了,如果没有提到,那就是我原创 的!呵呵,先卖个关子。FILE 菜单下有一个 EXPORT RESULTS(输出 结果)的按钮,点击以后,默认是.TXT 文本文件,好了,给你的输出文件起 个名字,选择保存位置,点击确定就 OK 了,回到你保存的输出结果文件, 发现它是一个不可识别的文件,那就直接把它的扩展名改成.TXT,打开它, 看看你的结果,包括 13 个指标,很好,这个.TXT 的结果文件可以被 SPSS 统计软件直接识别,不是很方便吗?(如果你愿意把数据一个一个地输入 统计软件, 我也没意见, 呵呵) 。 这里还有一个小窍门, 在用 SPSS 读取之前, 最好把你的结果文件调整
5、一下,这也是我发现的。把所有的指标都排列到第 一行,下面的结果要和指标一一对应,每个数据之间留空格(默认的) ,行 与行之间不要用回车,就是不要有空行,其实调整起来很简单,主要是调 节.TXT 文本文件阅读框的宽度。调好后,SPSS 软件直接识别,很方便,为 你节省很大工作量,不信就试试。 8、我用双层铺胶法,自制微电泳槽,第一层:0.75正常熔点胶,100l, 第二层:0.75低熔点胶,75l+25l 淋巴细胞悬液,用枪直接把凝胶吹到 自制的微电泳槽中,铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面,不必 担心脱胶的问题。 9、盖玻片用普通的就可以了,但是可以自做的,普通的盖玻片其实有点小了,
6、如果胶很多的话,第二层胶非常厚,这样不利于观察细胞,而且不利于电泳。 3。染色后要用双蒸水冲洗,据我的经验,冲要冲的非常干净,否则背景太亮了, 拍照后不容易分析。但是又不能使劲的冲,否则胶很容易掉下来。 4。电泳的时间一般是 20 分钟,电压各个细胞是不同的,你可以查查有关资料, 自己做做预试验。一般情况下,对照组的细胞的 tail DNA%应为 10%左右,不 超过 20%,如果尾巴太短了,也不好。 5。分析要用荧光显微镜的,具体的染液,有不同的激发波长。casp 软件在前面 的帖子中就有。很好用的,在推荐一次哦。最好用显微镜自带的相机,如果你的 技术好的话,可以在目镜照相,洗出来扫描后可以
7、分析的。 6.把 EB 滴加在胶上就可以了。观察时要在暗室里。 我是用 EB 的,电泳后,直接在胶板上滴上一滴,然后用水冲洗,用滤纸吸去多 余水分,荧光显微镜观察 10、SCGE 技术的原理技术的原理: 细胞核中的 DNA 为负超螺旋结构, 而且很致密, 通常 DNA 双链以组蛋白为核心, 盘旋而形成核小体。一般情况下,偶然的 DNA 单链断裂对核酸分子双股结构的 连续性影响不大,而且不易释放出来,但是,如果用去污剂破坏细胞膜和核膜, 用高浓度盐提取组蛋白,DNA 残留而形成类核。如果类核中的 DNA 有断裂,断 裂点将引起 DNA 致密的超螺旋结构松散,在类核外形成一个 DNA 晕圈。将类核
8、 置于电场中电泳,DNA 断片可从类核部位向阳极迁移,经荧光染色后,在阳极 方向可见形似彗星的特征性图像, 故称 “彗星试验”。 彗星尾部即为迁移出类核的 DN A 片段。 此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。 DNA 损伤越严 重,导致 DNA 超螺旋结构越松散,产生的断裂点越多,DNA 片段越小,从而在 彗星尾部出现的 DNA 断片越多,则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测 量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标,可以对 DNA 的损伤程度进行定量 分析。 随着 SCGE 技术的发展, 可测量的指标也越来越多, 而且更准确。 目前, 用于 SCGE 分析的指标主要分为四类
9、,包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其 中形状指标有彗星细胞率;距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、 尾部半径;强度指标包括头部 DNA 百分含量、尾部 DNA 百分含量、头部面积、 尾部面积等;矩类指标包括尾矩、Olive 尾矩等。 11、H2O2是作为阳性对照的吧?它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏 感程度是不同的,我觉得前几个数据有必要删掉,30 微摩尔以下的浓度应该是 会造成断裂的。 PI 染色我见过,染出来的效果也是很不错,是蓝色的。不一定 用 EB 染色呀,毒性又大。 12、单细胞琼脂糖凝胶电泳(comet assay) Single Cell Agaro
10、se Gel Electrophoresis (SCGE) 步骤: 一、 细胞悬液的制备: 1. 吸弃旧培养基,D-Hanks 冲洗 2 遍 2. 0.25%胰酶消化,待细胞变圆,间隙增大,立即终止消化,用弯头吸管轻轻 吹打细胞, 使成细胞悬液, 加入离心管, 1000rpm, 离心 10min, 弃上清, 以 1mlD-H anks 悬浮细胞,以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞 23106 个, 必须分散成单个。悬浮于 1mlPh7.4PBS 中,此步在暗室及较低温度下进行。 二、玻片制备: 1. 玻片磨砂。 2. 制备 0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和 0.5%低熔点琼脂糖(L
11、MPA)各 20ml。 用 p H7.4 PBS 配制。称 0.1g 溶于 20mlPBS,如 NMA 与玻片附着不紧,可升高其浓 度至 0.65%。 铺第一层胶:0.5%NMPA 100l 于磨砂玻片面,迅速盖上盖玻片,室温5min 使其固化,即为第一层胶; 第二层胶:37 0.5%LMPA 100l+30-50l(1-2x106)细胞悬液(10:1)混匀, 迅速铺于第一层胶上,盖新盖玻片,移入冰箱5min,使其固化。 * 余下的细胞 1000g10min 离心, 于 0.1-0.2ml 悬浮缓冲液中混匀, 做 Western- blot。 三、细胞溶解: 1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细
12、胞溶解液中,41 小时或过夜。玻片在细 胞消化液中可至少存放 4 周。 细胞溶解液配制 NaCl 146.1 g Na2EDTA 37.2 g Tris base 1.2 g 用约 12 克 NaOH 调节 pH 至 10。 用去离子水定容至 890ml。过滤除菌,为贮备液。室温保存。 应用液 加入 Triton X-100 至 1% DMSO 至 10%(消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基) 应用前冷藏 3060 分钟。 4、碱化处理及电泳:取出玻片,放入水平电泳槽中(正极端),并列放置,不留 空隙。 倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液, 高于胶 2mm, 无气泡。 放置 103
13、0 分钟,本室一般采用 15min,使 DNA 解链。25V, 300mA 电泳 20 分钟。通过调 节液面来调电压。(电压先调到最大,电流 300mA 然后通过液面来调节电压) 电泳缓冲应用液: 10N NaOH 30.0 ml(12 克) 200mM EDTA 5.0 ml (二钠为 0.372g) (附言:电泳缓冲液储备液: 10N NaOH 200g/500ml 水,两周内用。 200mM EDTA 14.89g/200ml 水,pH=10,室温保存。) 定容至 1000ml,混匀,电泳前新鲜配制。 可通过改变液面高度来调节电压。 5、中和: 切断电源,取出玻片,置染缸,中和缓冲液浸洗
14、,3 次5min。 中和缓冲液: Tris base 48.5 g 去离子水 定容至 1000ml 用10 N HCl 调节 pH 至 7.5。室温保存。 6、染色 呈中性后,凉干玻片,50l EB 应用液染色,盖上新盖玻片。 EB 染色液(10贮备液) EB 1 mg 去离子水 20 ml 室温避光保存。临用时将贮备液稀释 10 倍。使终浓 度为 5g/ml 以上除中和及染色外,各步均应在暗处进行,以避免额外的 DNA 损伤。 7、镜检及结果评价 EB 染色后的 DNA 样品应尽快在荧光显微镜下观察。 未受损细胞表现为以圆形荧 光核心,即彗星头部,没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极,形成一个
15、亮的头 部和尾部。用目镜测微尺或拍摄400 倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑 选 25 个细胞测定。 彗星尾长度 70m 为重度损伤 裂解液中,最难溶解的是 SLS,它在中性的时候不易溶于水,所以你把其他的药 品加进去后,先不要加 SLS,这里需要磁力搅拌器搅拌,但是时间不会很长。溶 解后,用 NaoH 把 PH 调到 10,这里调 PH 值要用 NaoH 固体,然后把 SLS 加进 去,在用磁力搅拌器搅拌,一般需要加热,50 度左右就可以了。大约搅拌 1 个 小时就可以溶解。 这时, 溶液应该是透明的, 不是乳白色的。 加热溶解的过程中, 可能会损失一定的水分,等搅拌完了后,你要把溶液的
16、量补充到你最后需要的体 积。当你从冰箱中取出裂解液后,裂解液如果有沉淀,你就把它放在 37 度水浴 中让它充分溶解,然后把 DMSO 和 Triton-100 加进去,这时,还是乳白色的, 你把他放在 37 度中放一会就可以了。 注意, 溶液的颜色是透明清亮的, 浑浊的话, 不能起到裂解的效果,最后跑不出彗星来。 中性条件跑出来的是 DNA 的双链,单链断裂不会出来,而强碱性条件下,破坏 了断裂部位连接碱基的氢键,这样,双链断裂也就成了单链形式,可以说碱性检 测的是“双链和单链断裂的综合损伤”,两种电泳条件的最大区别是适用于不同的 实验需求。碱性条件的 SCGE 的建立也是为了满足不同实验需要。实践中要根据 DNA 致伤因素选择实验条件,如:电离辐射对 DNA 的损伤以双链断裂为主,应 该选择中性 SCGE,而且可以排除环境因素对 DNA 损伤的影响(因为 DNA 很容 易受到环境因素的影响而断裂单链为主) ,如果用碱性的话,就不能区分哪 些是实验因素引起的断裂,哪些是其它影响因素引起的断裂。如果实验致伤因素 是以 DNA 单链为主,那就应该选择碱性 SCGE 了。