706编号彗星实验要点

《706编号彗星实验要点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《706编号彗星实验要点（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮， 用 CASP 软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些 教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细 胞中的 DNA 片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用 的 是 中 性 条 件 ， 20V， 200mA,20min, 凋 亡 细 胞 观 察 宜 选 用 10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋 20 分钟应该没问题， 但是我认为您的电泳时间过长， 当然我不知道 您的电泳条件（电压、电流、 ） ，我认为 20 分钟足够了，

2、时间长了一是浪费 时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道， 最好不要少于 1.5 小时 3、一般 100ul0.5低熔点胶中含 400 个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看 ge=0 5、 注意， CASP只读.tif扩展名的图像， 如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg 格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简 单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。 其次，您的染色液量我觉得多了点，我用 2ug/ml，1ml 注射器 1 滴就可以。 第三， 要忠于实验结果， 图象内容不能更改， 可以

3、用 ACDSEE 或 PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、 。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影 响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大 影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以 在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一 个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再 把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背 景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比 性。 结果的保存，记得好像使用

4、说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创 的！呵呵，先卖个关子。FILE 菜单下有一个 EXPORT RESULTS（输出 结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT 文本文件，好了，给你的输出文件起 个名字，选择保存位置，点击确定就 OK 了，回到你保存的输出结果文件， 发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它， 看看你的结果，包括 13 个指标，很好，这个.TXT 的结果文件可以被 SPSS 统计软件直接识别，不是很方便吗？（如果你愿意把数据一个一个地输入 统计软件， 我也没意见， 呵呵） 。 这里还有一个小窍门， 在用 SPSS 读取之前， 最好把你的结果文件调整

5、一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第 一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的） ，行 与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调 节.TXT 文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS 软件直接识别，很方便，为 你节省很大工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75正常熔点胶，100l， 第二层：0.75低熔点胶，75l+25l 淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到 自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必 担心脱胶的问题。 9、盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了，

6、如果胶很多的话，第二层胶非常厚，这样不利于观察细胞，而且不利于电泳。 3。染色后要用双蒸水冲洗，据我的经验，冲要冲的非常干净，否则背景太亮了， 拍照后不容易分析。但是又不能使劲的冲，否则胶很容易掉下来。 4。电泳的时间一般是 20 分钟，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料， 自己做做预试验。一般情况下，对照组的细胞的 tail DNA%应为 10%左右，不 超过 20%，如果尾巴太短了，也不好。 5。分析要用荧光显微镜的，具体的染液，有不同的激发波长。casp 软件在前面 的帖子中就有。很好用的，在推荐一次哦。最好用显微镜自带的相机，如果你的 技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以

7、分析的。 6.把 EB 滴加在胶上就可以了。观察时要在暗室里。 我是用 EB 的，电泳后，直接在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多 余水分，荧光显微镜观察 10、SCGE 技术的原理技术的原理： 细胞核中的 DNA 为负超螺旋结构， 而且很致密， 通常 DNA 双链以组蛋白为核心， 盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的 DNA 单链断裂对核酸分子双股结构的 连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜， 用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。如果类核中的 DNA 有断裂，断 裂点将引起 DNA 致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个 DNA 晕圈。将类核

8、 置于电场中电泳，DNA 断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极 方向可见形似彗星的特征性图像， 故称 “彗星试验”。 彗星尾部即为迁移出类核的 DN A 片段。 此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。 DNA 损伤越严 重，导致 DNA 超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA 片段越小，从而在 彗星尾部出现的 DNA 断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测 量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对 DNA 的损伤程度进行定量 分析。 随着 SCGE 技术的发展， 可测量的指标也越来越多， 而且更准确。 目前， 用于 SCGE 分析的指标主要分为四类

9、，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其 中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、 尾部半径；强度指标包括头部 DNA 百分含量、尾部 DNA 百分含量、头部面积、 尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive 尾矩等。 11、H2O2是作为阳性对照的吧？它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏 感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30 微摩尔以下的浓度应该是 会造成断裂的。 PI 染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。不一定 用 EB 染色呀，毒性又大。 12、单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay） Single Cell Agaro

10、se Gel Electrophoresis (SCGE) 步骤： 一、 细胞悬液的制备： 1. 吸弃旧培养基，D-Hanks 冲洗 2 遍 2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻 吹打细胞， 使成细胞悬液， 加入离心管， 1000rpm， 离心 10min， 弃上清， 以 1mlD-H anks 悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞 23106 个， 必须分散成单个。悬浮于 1mlPh7.4PBS 中，此步在暗室及较低温度下进行。 二、玻片制备： 1. 玻片磨砂。 2. 制备 0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和 0.5%低熔点琼脂糖(L

11、MPA)各 20ml。 用 p H7.4 PBS 配制。称 0.1g 溶于 20mlPBS，如 NMA 与玻片附着不紧，可升高其浓 度至 0.65%。 铺第一层胶：0.5%NMPA 100l 于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温5min 使其固化，即为第一层胶； 第二层胶：37 0.5%LMPA 100l+30-50l（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀， 迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱5min，使其固化。 * 余下的细胞 1000g10min 离心， 于 0.1-0.2ml 悬浮缓冲液中混匀， 做 Western- blot。 三、细胞溶解： 1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细

12、胞溶解液中，41 小时或过夜。玻片在细 胞消化液中可至少存放 4 周。 细胞溶解液配制 NaCl 146.1 g Na2EDTA 37.2 g Tris base 1.2 g 用约 12 克 NaOH 调节 pH 至 10。 用去离子水定容至 890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。 应用液 加入 Triton X-100 至 1% DMSO 至 10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基） 应用前冷藏 3060 分钟。 4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留 空隙。 倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液， 高于胶 2mm， 无气泡。 放置 103

13、0 分钟，本室一般采用 15min，使 DNA 解链。25V, 300mA 电泳 20 分钟。通过调 节液面来调电压。(电压先调到最大，电流 300mA 然后通过液面来调节电压) 电泳缓冲应用液： 10N NaOH 30.0 ml（12 克） 200mM EDTA 5.0 ml （二钠为 0.372g） (附言：电泳缓冲液储备液： 10N NaOH 200g/500ml 水，两周内用。 200mM EDTA 14.89g/200ml 水，pH=10,室温保存。） 定容至 1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。 可通过改变液面高度来调节电压。 5、中和： 切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗

14、，3 次5min。 中和缓冲液： Tris base 48.5 g 去离子水 定容至 1000ml 用10 N HCl 调节 pH 至 7.5。室温保存。 6、染色 呈中性后，凉干玻片，50l EB 应用液染色，盖上新盖玻片。 EB 染色液(10贮备液) EB 1 mg 去离子水 20 ml 室温避光保存。临用时将贮备液稀释 10 倍。使终浓 度为 5g/ml 以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的 DNA 损伤。 7、镜检及结果评价 EB 染色后的 DNA 样品应尽快在荧光显微镜下观察。 未受损细胞表现为以圆形荧 光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个

15、亮的头 部和尾部。用目镜测微尺或拍摄400 倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑 选 25 个细胞测定。 彗星尾长度 70m 为重度损伤 裂解液中，最难溶解的是 SLS,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药 品加进去后，先不要加 SLS，这里需要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。溶 解后，用 NaoH 把 PH 调到 10，这里调 PH 值要用 NaoH 固体，然后把 SLS 加进 去，在用磁力搅拌器搅拌，一般需要加热，50 度左右就可以了。大约搅拌 1 个 小时就可以溶解。 这时， 溶液应该是透明的， 不是乳白色的。 加热溶解的过程中， 可能会损失一定的水分，等搅拌完了后，你要把溶液的

16、量补充到你最后需要的体 积。当你从冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，你就把它放在 37 度水浴 中让它充分溶解，然后把 DMSO 和 Triton-100 加进去，这时，还是乳白色的， 你把他放在 37 度中放一会就可以了。 注意， 溶液的颜色是透明清亮的， 浑浊的话， 不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星来。 中性条件跑出来的是 DNA 的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏 了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检 测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的 实验需求。碱性条件的 SCGE 的建立也是为了满足不同实验需要。实践中要根据 DNA 致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对 DNA 的损伤以双链断裂为主，应 该选择中性 SCGE，而且可以排除环境因素对 DNA 损伤的影响（因为 DNA 很容 易受到环境因素的影响而断裂单链为主） ，如果用碱性的话，就不能区分哪 些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。如果实验致伤因素 是以 DNA 单链为主，那就应该选择碱性 SCGE 了。