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1、微生物代谢控制发酵,王 腾 飞 13869144397,第五章 代谢控制发酵的应用,第一节 糖代谢与控制 糖代谢的途径；糖代谢的调节机制 第二节 柠檬酸发酵机制与代谢调控 柠檬酸的生物合成途径；柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制；柠檬酸发酵的产率；柠檬酸产生菌的育种 第三节 脂类代谢与控制 脂类代谢与调节；谷氨酸的生物合成途径；谷氨酸代谢调节机制；谷氨酸生产菌的育种思路,第五章 代谢控制发酵的应用,第四节 氨基酸代谢控制与发酵 赖氨酸的生物合成途径；赖氨酸代谢调节机制；赖氨酸生产菌的育种思路 第五节 核苷酸类物质的代谢控制与发酵 核苷酸生物合成的调节机制；肌苷发酵的代谢控制育种 第六节 抗生素发
2、酵的代谢与控制 抗生素的基本合成途径、关键酶、调控措施。,淀粉葡萄糖,第一节 糖代谢与控制,-淀粉酶及-淀粉酶水解支链淀粉的示意图,淀粉降解,1. 到分枝前4个G时，淀粉磷酸化酶停止降解 2.由转移酶切下前3个G，转移到另一个链上 3.脱支酶水解-1，6糖苷键形成直链淀粉。脱下的Z是一个游离葡萄糖 4.最后由磷酸化酶降解形成G-1-P,G1P,脱支酶,磷酸化酶,海藻糖,乳糖,蔗糖,半乳糖,甘露糖,单磷酸己糖途径（HMP）,磷酸戊糖循环（PP环）,糖酵解途径（EMP）,双磷酸己糖途径（HDP）,三羧酸循环（TCA）,柠檬酸循环,克雷布斯循环,乙醛酸循环,ED途径 2-酮-3脱氧-6-磷酸葡萄糖酸
3、 裂解途径,CO2固定作用 伍德-沃克曼反应,丙酮酸,CO2 + H2O,各种代谢途径的利用比例,多种代谢途径可以同时存在于一个细胞内，不同代谢途径在细胞中存在的比例因微生物不同而异 只有少数细菌以HMP途径作为有氧分解的唯一途径，如醋酸杆菌等；而有些微生物中只有EMP或ED途径,+,丙酮酸,裂解,脱氢,异构,产能,脱水,异构,糖酵解的代谢途径,E2,E1,E3,TCA,三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle）又柠檬酸循环（Citric Acid Cycle），是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸
4、，因此得名；或者以发现者汉斯阿道夫克雷伯命名为克雷伯氏循环，简称克氏循环（Krebs cycle）。 三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。,ATP + 0.5ADP,能 荷 (Energy charge),ATP + ADP + AMP,=,需能 ATP分解 能荷降低 激活催化糖类分解的酶 解除ATP对酶的抑制 加速糖酵解、TCA循环 多产生能量,多能 ATP增加 能荷升高 激活糖元合成的酶 抑制糖分解途径关键酶 减慢糖酵解、TCA循环 少产生能量,糖代谢的能荷调节,糖代谢的生物素调节,（2）生物素的调节,生物素是羧化酶的辅酶，它本
5、身就是一种B族维生素B7。,生物素，又称为VH或VB7。是附有一个噻吩环的尿素衍生物。,生物素主要是影响糖代谢的速度 生物素充足时，糖分解速度提高，造成乳酸积累 生物素缺乏时，丙酮酸氧化能力下降，乙醛酸途径基本是封闭的,生物素充足时：,苹果酸、草酰乙酸脱羧反应活跃，琥珀酸氧化能力增强，倾向于完全氧化，ATP增加，蛋白质合成加剧，谷氨酸剧减。,生物素缺乏时：,苹果酸、草酰乙酸脱羧反应停滞，琥珀酸氧化能力弱，异柠檬裂解酶很少，乙醛酸循环微弱，完全氧化能力降低，ATP减少，蛋白质合成降低，大量积累谷氨酸。,第二节 柠檬酸发酵机制与代谢调控,柠檬酸citric acid,取代羧酸羟基酸醇酸,乳酸,苹果
6、酸,酒石酸,柠檬酸 （枸椽酸）, ,-羟基丙酸,2-羟基丙酸,3 2 1,羟基丁二酸,2,3- 二羟基丁二酸,2-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸,*,*,*,*,*,柠檬酸又名枸橼酸。存在于柠檬、菠萝、葡萄等水果中，此外，天麻、覆盆子、五味子等中药中也有存在。,柠檬酸为无色晶体，常一分子结晶水。易溶于水和乙醇。具有多元羧酸的性质，易与金属离子形成络合物。,柠檬酸与酒石酸、苹果酸一样，广泛用作食品的酸味剂。在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体，临床上，用柠檬酸作矫味剂。许多柠檬酸盐具有特定的生理活性，如：枸橼酸铁铵（抗贫血药），枸橼酸铋钾（抗溃疡药）等。柠檬也可用于与碱性药物成盐，成为溶于
7、水的制剂，如枸橼酸哌嗪（抗蠕虫药）。,1、柠檬酸的发酵机制,2C6H12O6 + 3O2 2C6H8O7 + 4H2O,理论产率： 106.6% 116.6%,2、柠檬酸的代谢控制,能够生产柠檬酸的微生物很多 工业上以淀粉糖为原料直接发酵生产柠檬酸的主要是曲霉属（Aspergillus）菌株 黑曲霉（Aspergillus niger）,诱变育种（breeding by induced mutation） 指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。 在此过程中，诱变和筛选是两个主要环节。,诱发
8、突变（induced mutation） 物理因素 紫外线（ultraviolet light） X射线和射线 化学因素 碱基结构类似物 与核酸上碱基起化学反应的诱变剂 移码诱变剂,诱变育种的基本环节,诱变育种的基本原则 选择简便有效的诱变剂 挑选优良的出发菌株 处理单细胞或单孢子悬液 选用最适的诱变剂量 充分利用复合处理的协同效应 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 设计高效筛选方案 创造新型筛选方法,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,1、形态学观察法,黑曲霉的形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系，通过选育形态突变株，有助于柠檬酸高产菌株的获得。,例如，选育在葡萄糖培养基上孢子不生长、迟长或者
9、少长的突变株。,？,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,2、透明圈法,甘薯粉 10% 琼脂 2% 碳酸钙 0.5%,？,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,3、显色圈法,麦芽汁培养基 pH指示剂 （溴酚蓝 0.01%）,？,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,4、高渗透压法,高产柠檬酸的菌株必须在高糖和高柠檬酸浓度的培养基上能够生长，即具备耐受高糖和高柠檬酸的能力。 甘薯粉 15% . 柠檬酸 20% .,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,5、选育不分解柠檬酸的突变株,用以柠檬酸为唯一碳源的培养基， 选择菌体不生长或生长微弱的突变株。,柠檬酸发酵优良突变株的筛选,6、选育某些氨基酸缺陷的突变株 如：谷氨酸缺陷型、精氨酸缺陷
10、型等,7、选育抗药性突变株 如：寡霉素抗性、萘啶酮酸抗性等,8、选育强化CO2固定反应的突变株 如：将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体上，使之扩增,第三节 脂类代谢与控制,脂类物质,脂肪,磷脂,固醇,蜡,脂类的代谢与调节,多不饱和脂肪酸,含两个或两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。如亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳六烯酸等。 多不饱和脂肪酸可广泛用于医药、食品、化装品、饲料等领域。, -亚麻酸,是人体不能缺少、自身又不能合成或替代的必需脂肪酸。 人体一旦缺乏，首先至关重要的前列腺素PGE1、PGE2、PGE3、就不能合成，免疫、心脑血管 生殖内分泌等系统就会出现异常，发生紊乱
11、，从而引起高血脂、高血压、血栓症、动脉粥样硬化、风湿病、糖尿病、皮肤粗糙、加速衰老化等一系列疾病。 特别是对脑组织的生长发育相当重要，因为脑重量的20%是由必需脂肪酸组成的。,产生菌：多用被孢霉、毛霉、红教母、小克银汉霉,-亚麻酸Gamma linolenic Acid（十八碳三烯酸，维生素F，Octadecatrienoic Acid，GLA）,育种措施1：切断或减弱支路代谢,育种措施2：解除反馈调节,耐高浓度-亚麻酸突变株,-亚麻酸结构类似物抗性突变株 如 LTBr,育种措施3：增加前体物质的合成,育种措施4：选育6脱氢酶活力强的突变株,TTC酶活测定法,TTC是一种无色的氧化还原剂， 能
12、被6脱氢酶还原成红色的 物质，红色越深，酶活越强。,育种措施5：强化能量代谢,提高菌体细胞内ATP的水平， 有利于脂肪酸的合成。,选育呼吸抑制剂抗性突变株 （如抗丙二酸、氰化钾、亚砷酸） 选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 （如抗羟胺2，4二硝基酚） 选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 （如抗羟胺2，4二硝基酚） 选育抑制能量代谢的抗生素抗性突变株 （如抗寡霉素、缬氨霉素）,育种措施6：选育低温生长突变株,细胞膜由脂质和蛋白质组成，脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，细胞膜的流动性越大，适宜在低温下生长。,育种措施7：选育耐高糖的突变株,谷氨酸的生物合成机制与代谢调节,谷氨酸发酵作为重点： （1）是
13、代谢控制发酵的重点 （2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的,一、谷氨酸的生物合成途径 主要有： Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 -KGA（-酮戊二酸）的还原氨基化 这6条途径之间是相互联系和相互制约的。,二、谷氨酸代谢调节机制 谷氨酸发酵是控制磷脂合成代谢的典型例子。 正常情况下，谷氨酸产生菌的细胞膜不允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。在谷氨酸发酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、添加吐温60或青霉素等手段来调节细胞膜的渗透性，使细胞允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。,（1）优先
14、合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢流转向天冬氨酸。 （2）谷氨酸脱氢酶（GD）的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。 （3）柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈抑制和顺乌头酸的反馈抑制。,（4）异柠檬酸脱氢酶的调节 细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当-酮戊二酸过量时，对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成-酮戊二酸。 （5）-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生产菌中先天性丧失或微弱。,（6）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。 （7）谷氨酸的合成还与糖代谢、氮代谢的
15、调节有关。,三、谷氨酸生产菌的育种思路,第四节 氨基酸合成的代谢调节,本节以赖氨酸为例，说明氨基酸合成的调节方法,谷氨酸棒杆菌Lys合成途径 葡萄糖 协同反馈抑制 天冬氨酸 AK 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸半醛 PS HD 二氨基庚二酸(DAP) 高丝氨酸（Hom) HK 赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) 异亮氨酸 AK 天冬氨酸激酶；PS 二氢吡啶二羧酸合成酶； HD 高丝氨酸合成酶；HK 高丝氨酸激酶,各种氨基酸代谢控制育种,核苷酸合成的代谢调节,肌苷（inosine）又名次黄嘌呤核苷， 可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，还能提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的ATP水平提高。,1枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制：,2枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节控制,
