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1、.,三、原核生物的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内
2、的数量可以达到10200个或更多。,.,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,三、原核生物的质粒,.,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染
3、色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,.,几种代表性质粒：,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,.,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the
4、genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,.,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R
5、因子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor）,.,产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 C
6、ol因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个copy。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,.,降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难
7、以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4. 降解性质粒,.,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌 。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究
8、中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,.,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒（mega质粒）,.,基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。,原核生物基因系统： 启动子（基因） 操纵子 操纵子（基因） 基因调控系统 结构基因 调节基因,.,细胞水平
9、：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同,染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。,.,一些真核生物和原核生物基因组的比较,生 物 单倍体的分子量 核苷酸 已知染色体数 约数（Da） 对数 基因数 人 32 35 1012 57 109 4000 黑腹果蝇 4 7.9 1010 8.0 107 50006000 粗糙脉孢菌7 2.8 1010 4.5 107 500 大肠杆菌1 2.5 109 3.8 106 1027 噬菌体T41 1.1 108 2
10、.0 105 135 噬菌体1 3.2 107 4.8 104 35 噬菌体MS21 1.1 106 3.5 103 3,.,遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序,密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位 不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。 起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 终止密码子：UAA、UGA、UAG,.,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒” 原核生物的质粒,线粒体 细胞质基因叶绿体 （质体）中心体 动 体 共生生物：卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨
11、大质粒 降解性质粒,.,第二节 基因突变和诱变育种,突变（ mutation ）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,.,依表型的改变分为： 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突
12、变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,（一）基因突变的类型,.,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,.,.,定义：每一细胞在每一世代中发生某一性
13、状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutant或reverse mu
14、tant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,（二）突变率,.,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状突变率 E. coli抗T1噬菌体3 108 E. coli抗T3噬菌体1 107 E. coli不发酵乳糖1 1010 E. coli 抗紫外线1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素1 107 S. aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105,.,（三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 不对应性：突变的性状与突变原因
15、之间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,.,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其
16、环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。 从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。,.,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理，设计了左方的实验。,1. 变量试验fluctuation test,.,2.涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,.,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6 （2.6 108 5 104）=
