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1、1,细胞培养,2,一 原代培养（略）,3,二. 传 代 培 养,准备及注意事项 换 液 传 代 冻 存 复 苏 MTT,4,准备事项,紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分钟后方可进入实验室. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 带手套,并用酒精擦拭之. 准备好实验必需用品. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 超净工作台内操作完成后， 要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯,镊子,试管架等物品外,其他都要拿出工作台外. 紫外灯照射30分钟.,5,换液,把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子; 观察瓶内培养基的颜色, 是否浑浊等; 放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内,点燃酒
2、精灯,拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒. 取下盖子,烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口; 拿出PBS液瓶子,烧瓶口和镊子;用镊子将塞子取出,烧瓶口（至少10圈）。,6,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子； 9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意： 1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱
3、时，应把盖子拧开少许。,7,传代,1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。,8,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培
4、养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；,9,10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。 11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。,10,冻存,1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超
5、净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。,11,6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子； 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟后取出； 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情
6、况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。,12,11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。 14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。 15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。,13,16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管1.5ml。 17.盖上盖子，用封
7、口膜封好,标上细胞名称和日期 . 18.冻存方式：430分钟，-2015分钟，-8060分钟，最后转移到液氮罐内。 注意： 冻存管移动时要夹在冰块中间。,14,复苏,1. 取一敞口瓶，内装蒸馏水，放入电热恒温水槽中，温度设置为39.0。 2. 等达到39.030分钟后，用镊子将欲复苏的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶内，晃动，使冻存管内完全液化。 3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已装有5ml新鲜培养基的培养瓶内。,15,6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身
8、，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；,16,MTT法,1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照射2个小时以上。 2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加胰酶消化，加培养基，计数。 （方法及步骤同传代1-13步。） 3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200l. 4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔200l. 5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下观察，标明名称，序号和日期。,17,6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 用200l的枪将孔内的
9、培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200l。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20l。,18,11.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下 观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养4 小时。 12.取出96孔板，倒掉孔内的液体，每孔加 DMSO150l，放入酶标仪内，振荡600秒， 读数即可。 注意： 本实验以CHL细胞为例. 加DMSO时，带口罩和手套。 放入酶标仪内时，96孔板勿盖盖子。 多重复几次。,19,溶液的配制,PBS
10、 RPMI1640培养基 消化液 冻存液 清洁液 MTT 其它溶液,20,PBS配制,之后，加1000ml三蒸水,调节PH值在 7.2-7.4之间,高压121 ,30分钟,4备用。,21,RPMI1640培养基的配制：,取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml，在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解； 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100g/ml）； 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-20备用。 注意 烧杯要泡过酸，并在紫外线下照射至少30分钟。,22,消化液的配制,称取胰蛋白酶粉0.5克，溶入PBS缓冲液200m
11、l， 混匀，调整PH值到7.2， 过滤除菌，用1.5ml的EP管分装，-20冻存。 取少许放入已培养的无污染的培养基中 培养。,23,冻存液的配制,高压过的二甲基亚砜DMSO，胎牛血清和无血清培养基按1:3:6的比例配制。 例如配制10ml的冻存液： 高压的小瓶中加3ml过滤的胎牛血清， 再加6ml培养基，最后加1ml的 DMSO,混匀即可。,24,清洁液的配制,25,一般常用次强液。新配制的清洁液为棕红色， 多次使用后，成绿色时就不能再用, 需重新配制。 注意： 保护自己； 先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量太多，使容器破裂。,26,噻唑蓝M
12、TT液配制,方法 称取25mgMTT, 加入5ml PBS液, 混匀, 即成5mg/ml的MTT液； 用0.22m的微孔滤器除菌, 避光, 4保存一周内使用. 原理 活细胞的线粒体的乳酸脱氢酶可使MTT（黄绿色）分解，产生兰紫色结晶状甲赞颗粒，积淤细胞内和细胞周围；其量与细胞数成正比，也与细胞活力成正比。 注意 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力, 不能测定细胞绝对数.,27,其它溶液的配制,95%到75%的酒精的配制比例为4:1， 例如,配制100ml75%的酒精,80ml 95%酒精加20ml三蒸水即可。 36%-38%的浓HCL到5%的稀HCL的配制比例为3:17， 例如,配制1000
13、ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即可。,28,细胞计数,方法 吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml=四大格细胞总数/4 104个 注意 镜下见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算; 若细胞团数量占10%以上，重新制备细胞悬液。 计数时，计左侧和上方的压线细胞，右侧和下方的压线细胞不应该计在本方格之内。,29,血清灭活,把血清置于56的水浴锅里待完全溶解后开始计时，30分钟后分装成20ml的小瓶，放-20备用。,30,实验用品的洗涤,橡胶，塑料用品 玻璃器皿,31,橡胶
14、，塑料用品,用自来水冲洗后放入专用烧杯内,加入蒸馏水，使之淹没物品稍许，放在电炉上加热； 等水开时开始记时，三十分钟后取下，倒掉烧杯内的水，自来水冲洗3遍，蒸馏水冲洗2遍，放烤箱下层中烘干； 烘干后浸泡在盐酸中，至少30分钟； 将盐酸倒掉，用自来水冲洗十遍，蒸馏水冲洗三遍，放入烤箱上层烘干 烘干后放入饭盒内高压，之后放烤箱上层再次烘干即可使用,32,玻璃器皿,用自来水冲洗三遍，用蒸馏水洗三遍，放入烤箱下层烘干， 放入清洗缸即酸缸内，让整个器皿没入清洗液中 ,时间为过夜或者至少8个小时以上. 取出器皿，用自来水冲洗十遍，再用蒸馏水冲洗三遍后，放入烤箱上层烘干 。 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘干即可使用。,
