常用的限制性内切酶课件

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1、第十五章,药物研究的生物化学基础,第一节 生物药物制造的生物化学基础 第二节 药物质量控制的生物化学基础 第三节 药理学研究的生物化学基础 第四节 与药物设计有关的生物化学原理,生化制药的六个阶段： 1、原料的选择和预处理；2、组织及细胞的破碎；3、从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；4、采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来；5、干燥及保存； 6、制剂。 以上各阶段在不同的生化药物制备中，根据所选材料的不同，可灵活取舍选择使用。,第一节 生物药物制造的生物化学基础,生化制药的六个阶段： 1、原料的选择和预处理；2、组织及细胞的破碎；3、从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；4、采用多种生化技

2、术从粗品中将目的物精制 出来；5、干燥及保存； 6、制剂。,第一节 生物药物制造的生物化学基础,一、生物药物制备方法的特点,（一）生物药物制造技术特点 1、目的物存在于组成复杂的生物材料中， 无固定工艺可循。 2、生物材料中的目的物含量极微，纯化步 骤多，回收率低。 3、目的物分离后易变性失活，增加制备的难度。,4、各种理化、生物因素影响各组分，制造工艺可变性很大，必须确定明细流程，以能重复。 5、为保证生物活性和结构完整，采用温和的“多阶式”或“逐级分离”。工艺流程长，操作繁琐。 6、因对环境条件敏感，产品均一性（纯度）的评价是有条件的。不能只凭一种方法下结论。,（二）生物药物分离纯化方法主

3、要原理： 1、根据不同组分分配率的差别进行分离，如：溶剂萃取，分配层析，吸附层析，盐析，结晶等。 小分子生物药物（AA、脂类药物、维生素和固醇类药物等。 2、根据生物大分子的特性采用多种手段交互进行分离： 1）根据分子大小和形状不同进行分离，如凝胶过滤法、透析和超滤法、密度梯度离心法等；,2）根据分子的带电性质进行分离，如离子交换 层析法、电泳法、等电聚焦法；3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离， 如：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂分级沉淀法、逆流分配法等； 4）根据配基特异性不同不同进行分离，如亲和层析法。,二、 生物合成技术原理,1、生物合成：是利用生物细胞的代谢反应（如微生物转化反应

4、）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。,微生物转化反应：是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。 可进行的转化反应包括：脱氢、氧化、脱水、缩合、脱羧、氨化、脱氨和异构化反应等。,最古老的生物转化，就是利用细菌将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。 生物转化还可用于把异丙醇转化成甘油进而二羟基丙酮；葡萄糖转化成葡萄糖酸，进而转化成一酮基葡萄糖酸或一酮基葡萄糖酸，以及将山梨醇转变成L一山梨糖等。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化和抗生素的生物转化等等。 其产物具有立体构型单一，转化条件温和，后处理简便，公害少。 广泛应用于制药工业。,烟酸羟基化微生物转化发酵:

5、将菌种接种到含烟酸培养液中进行转化发酵培养，不断添加烟酸到培养液中，维持浓度在0.1以上；培养结束后将培养液与菌体分离，培养液经酸化静置使6-羟基烟酸结晶析出,将培养液析出的6-羟基烟酸晶体，洗涤、干燥，得到纯度90的6-羟基烟酸产品。,生物合成技术： 基因工程、细胞工程基础上应用发酵法和酶法合成技术合成生化活性物质。 涉及的反应有50多种：如水解、脱氢、氧化、羟基化、环氧化、还原、氢化、酯化、异构化、氮杂基团氧化还原、硫醚开裂等等。,2、生物半合成技术： 指一个药物其部分结构由天然资源得到，然后用化学合成法制得最终产品或应用微生物转化法将化学合成的中间产物，通过某些生物合成步骤来解决药物合成

6、中难于进行的化学反应，从而获得最终有效化合物。,如应用真菌孢子进行孕酮的11-羟基反应。 应用天然获取的青霉素经化学合成氨苄青霉素。,R-COOH,青霉素酰化酶,氨苄青霉素,苯甘氨酸,青霉素,6-氨基青霉酸,三、生物技术原理,生物技术（biotechnology）是利用生物有机体或其组成部分发展新产品或新工艺的一种技术体系称为生物技术，又称为生物工程（bioengineering），包括：,1、基因工程：在体外，从DNA合成蛋白质过程。 2、细胞工程：细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 3、酶工程：用酶的催化作用进行物质转化，生产人们所需产品的技术 。

7、 4、发酵工程：对单一菌种进行培养，产生特定产品。,现代生物技术的核心内容： 重组DNA技术和单克隆抗体技术,（一）重组DNA技术（基因工程） 1、概念： 在体外将分离纯化或人工合成的DNA与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌或其他细胞），然后筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆的技术。因此基因工程也称为基因克隆或重组DNA技术。,2、基因工程操作过程主要包括： 1）目的基因的获取； 2）基因载体的选择与构建； 3）目的基因与载体的拼接； 4）重组DNA导入受体细胞； 5）筛选并无性繁殖含重组分 子的受体细胞（转化子）； 6）工程菌（或细胞）的大量 培

8、养与目的蛋白的生产。,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,二、基因工程的五大步骤 （分、切、接、转、筛） 一分载体和目的基因的分离 1、载体：将外源基因导入细胞的DNA 2、常用载体：质粒、噬菌体、M13噬菌体等。此外还有逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA。,1. 质粒 (plasmid),特点： 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。这也是筛选转化子细菌的根据。,2. 噬菌体(phage),噬菌体DNA分子为双链线状，其末端分别具有突出的12bp的互补单链，是天然的粘性末端，称为COS位点。当感染细菌后， 噬菌体借COS位点互补连接

9、形成双链环状结构。,噬菌体作为载体具有两个特点： (1) 噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右两臂上，其基因组中央含有70%的DNA是非必需的。 (2) 噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA片段重组后的大小介于原来的78%-105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的的噬菌体颗粒。,噬菌体DNA载体： gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,-插入型允许克隆的外源DNA片段较小，一般为7kb以下； -置换型载体允许外源DNA代替自身的生长非必需区，可容纳30kb的外源DNA。,动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他：,

10、3、对载体的要求： 1能独立复制，但需宿主的酶体系进行基因表达。 2有筛选标记：如抗药性基因。 3分子量不大，尽可能有多种内切酶的单一位点。 4可通过破碎细菌，用密度梯度离心法分离。,4、目的基因的来源： 1直接从染色体DNA分离，多用于原核生物。 2人工合成。 3从mRNA合成cDNA，需反转录酶。 4基因文库：是含有某种生物体全部基因的 随机片段的重组DNA克隆群体。,基因文库包括： （1）G文库：用基因组的总DNA来制备的称之。 基因文库制备过程：全部DNA分离提纯，经过酶切形成DNA片段，重组入同一个载体，成为重组 体，再转化到细菌保存起来。 （2）C文库：用细胞全部mRNA经反转录生

11、成cDNA，以之来建库。 应用“探针”可把目的基因钓出。,二切限制性内切酶的应用 1、作用识别核酸分子某些碱基序列并加以 切开。不同的限制酶其酶切点不同。 酶辩认的碱基序列一般为4-6个，而且这些碱基序列大多有回文结构。 2、回文结构即碱基排列顺序在顺读和反 读都是一样的。,限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE),定义：限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,W.阿尔伯 D.内森斯 H.史密斯 获得1978年诺贝尔生理学或医学奖。,鱼跳塘荷沐秋雨，荷沐秋雨晨风疾；疾风晨雨秋沐荷，雨秋沐荷塘跳鱼。,A m

12、an，a plan ，a canal， panama,作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。,分类 、 （基因工程技术中常用型）,+,Bam H,II型： 只有限制酶活性，无甲基化修饰活性； 对DNA的切割准确； 故II类酶被称为“分子生物学家的手术刀”。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hind,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口

13、、粘端切口,+,+,平端切口,粘端切口,Bam H,Hind,限制性酶切位点出现的概率： 识别4bp的酶 每1/44bp 即1/256bp 识别6bp的酶 每1/46bp 即1/4096bp,识别序列一般为4、6、8个碱基对（base pair,bp),三类特殊性质的II型限制性内切酶,同功异源酶 同尾酶 可变酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,+,Bst,同功异源酶:又称同裂酶,Bam H,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,

14、Bg l,+,+,同尾酶:,可变酶:,此类酶所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列超过6个碱基对。 例如：BstP I 识别下列序列，N为可变碱基。,-G G T N A C C-,3、酶作用的切口 （1）平端切口同一水平上切断DNA两股链。 （2）粘端切口两链切口错开24个核苷酸 如为四核苷酸切口，切口机率=(1/4)4=1/256 如为六核苷酸切口，切口机率=(1/4)6=1/4096 4、目的基因尽可能完整的切出。将载体切开、 以接纳目的基因。,常用的限制性内切酶,三接载体和目的基因连接成重组体 用同一酶切割载体和目的基因，两者切口端往往 互补，可用连接酶连接成为重组体

15、。 连接方式有： 1、粘端连接方式：在载体和目的基因上有共同 酶切位点。 2、尾接法：在载体和目的基因上无共同的酶切 位点。在尾部一条加polyG,另一条加polyG 3、人工连接器：在载体和目的基因上连上人工合 成的一段寡核苷酸，其碱基上含内切酶酶切位 点，可达到连接目的。,目 录,同聚物接尾法,人工接头及其应用,目 录,四转重组体的转化 即将重组体转入细菌体或细胞，重组体引 起宿主转化。 常用CaCl2处理细菌或细胞，使之膜通透性 增加，再将重组体直接引入细胞。,五筛DNA重组体筛选与鉴定 先扩增筛选出含目的基因的菌株反复筛选后克隆化再扩增,1、表型筛选： 1利用载体质粒对抗生素的耐药性进

16、行 筛选。 如质粒PBR322，对四环素及氨苄青霉素均耐药，如该质粒重组体导入无耐药的宿主菌后，此细菌变成有耐药性，可在含四环素及氨苄青霉素的培养基中生长。反之，无质粒重组体转化的宿主菌在该培养基中被杀死。,(插入失活法) 抗药性标记选择,2对营养素的依赖表型来筛选： 如重组体可自产生Leu+（自养型），使之转入不能产生Leu-（异养型）的宿主中，在不含Leu的培养液中就能生长，而不含重组体的宿主，在不含Leu的培养液中不能生长。,亮氨酸缺陷 型大肠杆菌,无亮氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进亮氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,2、电泳法（DNA限制酶切图谱分析）： 将重组体、原载体经限制性内切酶切割后， 进行电泳，据DNA片段大小与有无来区分载体 是否重组