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1、1,目的,血红蛋白结构和功能的回顾 Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血红蛋白检测说明 血红蛋白临床结果说明,2,血红蛋白的结构,血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.,Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.,三维结构,4 亚单位 2 alpha链 2 alpha genes 3 非 alpha链 : beta, delta, gamma 1 b gene , 1 d gene , 2 g genes,3,正常结果,Hb A: a2b2,H
2、b F: a2g2,Hb A2:a2d2,+,-,琼脂糖凝胶 Hydrasys (Sebia) 碱性缓冲液,成人,新生儿,4,血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES) ?,血红蛋白疾病 血红蛋白性质变化 : 血红蛋白分子病 结构异常, 一个或数个氨基酸变异或缺失, 都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变 常见血红蛋白变异体 b-globin : S C DPunjab E 血红蛋白含量变化 : 地中海贫血 合成或合成调控异常 : b globin b Thalassemias a globin a Thalassemias 合并型 : 血红蛋白分子病Hemoglobinopat
3、hies /地贫 Thalassemias,5,血红蛋白遗传病,遗传性疾病基因学图谱,正常基因,异常基因,6,异常血红蛋白类型,目前, 已经证实的有超过1000 种以上的变异体(a, b, g and d) 大部分变异体出现频率较低, 并且没有明显临床症状 4种主要变异体 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出现频率较高 ( 特定人群) 携带者会出现健康问题 儿童可能在出生时即伴随有严重症状,7,血红蛋白疾病的区域分布图,Thalassemias,8,常见与地中海区域: 意大利, 西班牙,希腊, 近东地区, 非洲北部. 同样常见于东南亚 : 泰国,印度, 越南,中
4、国, 印尼. 临床症状 * Beta 地贫重症型 - 严重贫血 (需要长期输血治疗) * Beta 地贫中间型 * Beta 地贫轻微型 - 无临床症状,Beta 地中海贫血,常见区域,bo 没有Beta链合成 b+ 合成能力下降,9,Alpha 地中海贫血,临床症状: 根据Alpha基因的表达状态, 有4个不同程度的Alpha地贫症状 * 1 个基因表达沉默: 静止型 (非常难检测到, 在出生会测到Hb Barts 1-2% ) * 2 个基因表达沉默: 轻型alpha地贫,在出生会测到Barts 2-10% * 3 个基因表达沉默: 血红蛋白Hb H病, 出生时出现2-30% Barts,
5、 儿童-成人出现 10-15% Hb H * 4 个基因表达沉默: Hb Barts胎儿水肿综合征 (死胎),常见区域 常见与远东地区,非洲和地中海区国家,10,11,12,镰刀型红细胞血症,变异体出现在 6 GAG (谷氨酸) GTG (缬氨酸),13,C型血红蛋白分子病,变异体位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys),Htrozygote composite,AC,SC,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,Homozygote,Chromosomes 11,Htrozygote,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g
6、,G,g,G,g,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,SC heterozygote compound,Chromosomes 11,Heterozygote,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,14,D型血红蛋白分子病,常见区域: 常见于印度.,特点: 变异体位置 b121 Glu (谷氨酸,负电荷) Gln (谷氨酰胺, 不带电荷) (D- Los Angeles = D-Punjab) (6 different Hb D according to the position of the mutation) 碱性
7、缓冲液中: 电荷下降 M电泳速度变度变慢,靠近Hb S,临床症状:,基因杂合体: 无症状 (仅在电泳中发现D区带) Hb A fraction: 65 70 % Hb D fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 Hb A fraction: absence Hb D fraction: 100 %,15,E型血红蛋白分子病,常见区域: 常见与东南亚地区.,特点: 变异位点 b26 Glu (谷氨酸,负电荷) Lys (赖氨酸,正电荷) 碱性缓冲液: 总体带电荷下降 凝胶电泳中,出现在HbC附近,临床症状:,杂合体: 无症状 Hb A fraction: 65 70 % Hb
8、 E fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 Hb A fraction: absence Hb E fraction: 100 %,16,下列情况下,需要进行血红蛋白检测,临床和遗传问题 (产前诊断) 贫血,小红细胞症 新生儿筛查 对来自地贫高发区人口,进行筛查 对诊断有帮助的其他信息 患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景 (输血记录) 血液全套检测, 网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳 (EDTA抗凝管) 离子平衡和溶血情况,17,血红蛋白检测的几种方法,目前, 血红蛋白检测步骤如下: - 电泳法对Hb进行检测 或者使用等电聚焦电泳法 - 使用 HPLC法进行
9、确认.,18,19,凝胶电泳结果识别表,20,在pH梯度的凝胶片上, 根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离 Hb电泳位置取决于缓冲液PH值 蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动 At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating 电泳分离效果好, 但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断,等电聚焦电泳法,介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法: - 通过毛细管电泳法, 即可以获得与IEF方法一样的分辨率,同时检测结果量值Hb A2/Hb F同样精确. - 出现异常变异体后: 使用下列方法确认: * ITANO tes
10、t (solubility test) * HPLC液相色谱 * Genotyping基因筛查,21,Capillarys 2,Minicap,全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2 / Minicap,22,毛细管电泳法原理,23,此时,电渗力(EOF)远远强于电场力. 因此,蛋白被动从正极向负极端移动.,正电极 +,EOF,负电极 -,Electro migration,蛋白电泳,DETECTION,INJECTION,24,Capillarys/Minicap血红蛋白电泳,血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程, 然后,在415nm紫外光下被检测并显示
11、出来. 正常质控品 必须在每天检测前使用 Capillarys : - 检测速度: 40 样品/小时 试管架1 至 7号位放置样品, 8号位放 4ml溶血素 Minicap : - 检测速度: 10 样品/小时 试管架1 至 26号位放置样品, 27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素),25,Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求,抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要对输血患者采血, 需要在输血前采集血液. 使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000 rpm,5分钟离心后样品) + 4C以上, 标本最多存放7天. 需要长期存放, 可以洗涤红
12、细胞后,放置于 -80C (可存放至少 3个月),26,Capillarys Minicap 血红蛋白条带识别表,27,Capillarys/Minicap区带识别表,Z 15 : Hb H Z 14 : / Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-Kaoshiung Z 12 : Hb Barts, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore. Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),denaturated Hb A Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A,
13、Hb Camperdown, Hb Phnom Penh Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Allegre. Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln,denaturated Hb E. Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb
14、C, Hb Kln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant,28,29,正常Hb A2 质控品,条带结果可录为QC,30,Hb AFSC质控品, 可用来作为参照曲线,便于异常结果的判断,31,Hbs A, F,A2 检测结果可通过颜色进行区分,异常区带显示为灰色,主要异常血红
15、蛋白变异体,Z15 Hb H Z12 Hb Bart Z10 Hb Hope Z9 Hb A Z7 Hb F Z6 Hb D Punjab Z5 Hb S Z4 Hb E Z3 Hb A2 Z2 Hb C,HbE,HbS,HbH,32,33,HbS 变异体, Hb A2 正常值 6 Glu Val,Hb A = 22,Hb S = 2S2,Hb A2 = 22,Capillarys/Minicap血红蛋白试剂优势:,无需前处理(不需要洗血和溶血)，直接检测 血红蛋白C和E能从A2分离开 根据S型和D型的细微电荷区别, 进行区分. 对于处于A和S之间的F给予个性化和聚焦的精确量化. 对A2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果 Hb Barts 和 Hb H可以很好的检测和量化 糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内,不影响检测结果,34,35,异常结果分析,36,Case 2:31 Y Female, 血红蛋白 12.8, 红细胞压积 37.4 (I),A = 84.1 % F = 1.5% A2= 5.5%,37,31 Y Female, Hgb 12.8, Hematocrit 37.4 (II),Alk,Acid,F,S,C,A2,C,S,F,-thala
