企业经营管理痰液细菌学检验的标准化操作程序

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1、企业经营管理痰液细菌学检验的 标准化操作程序 企业经营管理痰液细菌学检验的 标准化操作程序 痰液细菌学检验的标准化操作程序 卢先雷 1 前言前言 众所周知，传统习惯程序的痰标本细菌学检验其临床符合率并不高,其原因是多方面的。 除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微生 物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌可能 为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染，要证明 培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于痰培养的 标准化进展十分缓慢，以至在各版全国临床检验操作

2、规程上也未提出相应详细可行的令 全国同行公认的统一规范的标准化操作程序（SOP）和完整的痰液培养的质量控制办法。习 惯程序的痰标本细菌学检验的缓慢也很不适应临床诊断治疗的迫切性1。故而，建立规范而 快速的痰液细菌学检验的 SOP 对于提高呼吸系统感染病的诊治水平和控制抗生素的滥用等 问题均有重要的作用 痰培养阳性率普遍教低，临床符合率差的关键因素是痰标本采集不规范，不合格痰标本 将直接导致病原菌被分离的机会降低，大量正常菌群也会抑制病原菌的生长或干扰病原菌的 检出，降低了临床符合率；再有就是操作程序的不规范，不重视直接涂片，检验过程控制的 不严密也是导致临床符合率低的重要原因。我们通过 SOP

3、 的临床应用情况的分析，痰培养阳 性率和临床符合率均可能被提高，并且细菌分布统计结果显示本文与国外文献所报道的情况 基本一致2。 对于直接涂片的意义，在于判断标本中微生物有无、类型、染色特性、形态特征，标本的污 染情况，还可对痰标本中可能的病原菌初步诊断(依据人体被病原菌感染后的炎性渗出包裹 和白细胞吞噬反应)，判断是否存在复数菌感染，动态观察处于治疗过程中不同时期所送检 的标本中病原菌情况的变化（如同种病原菌数量的增减，机体的免疫反应，菌群的交替） 。 甚至可以推断临床治疗疗效和病人病情的变化和转归，医院内感染的发生等，具有重要意义 3。 为了满足高质量需求，对首代分离培养基应该进行严格的质

4、量控制4。另外，对首代分离培 养基的选用和搭配的合理化也需要进行探讨。 为了缩短鉴定时间，在细菌鉴定中可采用酶法鉴定：所谓酶法鉴定：国外八十年代中一 些微生物学家在研究中发现由于细菌在生长分裂过程中细胞内集聚了大量的与物质代谢相 关的各种酶类，可在短时间内释放到胞外（称胞外酶）可迅速分解相应底物。故而，当在高 灵敏微量生化反应培养基中加入大量浓厚的菌液时，则无须细菌繁殖就能在短时间内产生反 应。根据这一理论采用高灵敏微量生化反应单元与数值分类法相结合而成的酶法生化编码鉴 定 系 统 可 对 细 菌 进 行 快 速 鉴 定 （ 如 APIrapid20E/NH11n 、 SensititreAP

5、80 、 MicroScanRapidNegID3、VitekGNI+、RapIDonE、超声波辅助快速酶法革兰阴性杆菌鉴定系 统514） ，鉴定时间可缩短至 46 小时。但链球菌因为首代分离生长慢，菌落细小，不能收 集充足菌量，暂不能采用酶法鉴定，其鉴定仍沿用常规生化反应鉴定或免疫学方法鉴定. 2 标准化操作程序标准化操作程序 2.1 标本接收筛选方案标本接收筛选方案： 目测目测：黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、稠厚，呈现团块状的标本为合格标本； 而无色透明、有灰白片状物或黑色小点，有明显食物渣滓、纸屑灰尘的为不合格标本。 显微镜下筛选显微镜下筛选：对经过目测筛选的标本，在洗涤前还须再经过显

6、微镜下筛选：取约 0.1ml 痰 液（黄豆大小）用接种环均匀涂布成 22cm2 大小的涂膜，在显微镜下，凡脓细胞25/LP 且 鳞状上皮10/LP 的标本为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞+ 或鳞状上皮25/LP 的标本为不合格标本，应拒收。 2.2 标本预处理标本预处理： 按全国临床检验操作规程 （第 2 版） 15相关章节，采用先用 20ml 生理盐水洗涤两次，经 过 10ml 生理盐水稀释后，加入 1%的 PH7.6 的胰蛋白酶溶液消化 90min 后接种。并同时在洗 涤后制作原始痰涂片，进行染色镜检。 2.3 读片读片：根据人体对细菌/真菌感染在早期主要以非特异性免疫的细胞免疫为主

7、的特点，结 合呼吸系统生理病理特点，阐述痰液形成过程和排出过程，我们可以得知，在下呼吸道中感 染中形成的炎性渗出、包裹物中存在与感染直接相关的病原菌，在自然排痰的过程中会被上 呼吸道的正常菌群所污染，但污染菌位于炎性包裹物之外，且人体对正常菌群具有共生性保 护因而不会产生吞噬现象，借此理论，我们将选择痰标本中脓细胞成团块状分布，集中而不 稠密， 且周围无鳞状上皮细胞或无大量成团状分布的细菌球的区域为读片区， 认真收寻 2030 个视野中脓细胞聚集处的脓细胞胞浆中有无吞噬的细菌及细菌的染色排列特征，菌体特征 （如粗细、长短、扭曲）并作记录，将此作为确定病原菌的理论依据。 2.4 标本的接种培养标

8、本的接种培养：一般情况接种 BA、Choc（含万古霉素 50mg/L） 、麦康凯/MecK(即“分 科琼脂”NBIIA16)、CHROMagar，BA、Choc 置 5%CO2、35潮湿环境培养，麦康凯/MecK、 CHROMagar 置普通环境 35培养；怀疑为军团菌的加种 BCYE- 培养基，怀疑为百日咳的加 种 Boudet-Gengou 培养基，怀疑为肺结核的加种罗-琼氏培养基或采用商品化专门的分枝杆 菌培养基培养；怀疑为肺炎支原体感染的加种 Hayflick 双相培养基或采用免疫学及分子生 物学方法检测，肺炎衣原体须用免疫学或分子生物学方法。 2.5 读碟读碟：（经过 1824h 隔

9、夜培养，但孪生球菌、营养缺陷链球菌以及分枝杆菌则需延长培 养时间） 2.5.1G+菌：BA 生长、Choc 不生长、MecK 不生长，Gram 染色：分 G+co（革兰阳性球 菌）,G+b（革兰阳性杆菌） 2.5.1.1G+co依靠溶血特征，菌落形态、菌落颜色、菌体形态区分: 葡萄球菌：淡黄色/白色，中等大小，较凸，规则圆形，/ 溶血，较湿润，除金黄色葡萄 球菌外，一般不具有临床意义； 微球菌：黄色/白色/橙色，中等大小，较凸，规则圆形，不溶血，较干燥，不易乳化较葡萄 球菌生长缓慢，该菌一般无临床意义； 链球菌：白色/灰白色、凸起小菌落， 溶血为溶血型链球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷， 1.0-

10、1.5mm 大小的宽大 溶血为肺炎链球菌，该菌是最常见的肺部感染病原菌，在社区获得 性感染中有重要的地位；细如针尖，白色凸起 溶血的为草绿色链球菌，自然咯痰标本中 的草绿色链球菌一般不具有临床意义； 肠球菌：灰白，低凸，2.0mm 左右之 溶血菌落，较湿润，但一般不具有临床意义； 口腔球菌：白色凸起较大菌落，不溶血，黏着，接种针挑之则整个菌落挑起，琼脂上不留痕 迹。该菌偶尔可引起肺部的严重感染，一般好发生于 COPD 病人和肺气肿病人； 孪生球菌：白色、凸起细小菌落， 溶血，生长慢 48h 仅 0.20.4mm，在含羊血的 MH 琼脂 上不生长。该菌是上呼吸道的正常菌群组成之一，一般不导致肺部

11、感染； 2.5.1.2G+b依靠溶血特征，菌落形态、菌落大小、菌体形态区分： 棒状杆菌：白色 1.0-1.5mm 左右大小，较干燥，不溶血/狭窄 溶血的为白喉或一般棒状杆 菌；小而湿润，灰白/无色，半透明的为 J-K 棒状杆菌；灰白细小， 溶血的可能为假结核、 化脓放线菌、溶血分泌杆菌；除白喉杆菌外，假结核、化脓放线菌、溶血分泌杆菌是罕见的 咽喉部病源菌，棒状杆菌一般不导致肺部感染； 乳杆菌：细小，白色凸起 溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，无临床意义； 芽孢杆菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃状、蜡状、边缘不规则，不同种类菌落形态差异 巨大，宽大 溶血。延长培养时间，菌落从湿润变得干燥，

12、边缘呈放射状扩散，形成叶状、 掌状、雪花状、齿轮状等，常常为痰培养的污染菌； BA 生长、Choc 生长、MecK 不生长，Gram 染色：G+co 平面球菌、藻球菌：血琼脂上为 溶血，0.5-1.0mm 大小，在 Choc 上呈现金属色泽，无临 床意义。 2.5.2G-菌：根据形态分为 G-b（革兰阴性杆菌） 、G-co（革兰阴性球菌） 、以及根据对特殊营 养的需求对苛养性 G-b 进一步分类，常见的如嗜血杆菌，军团菌等： 2.5.2.1BA 生长、Choc 生长、MecK 生长，Gram 染色：G-b氧化酶、分科琼脂颜色 肠杆菌：氧化酶（-） ，分科琼脂上黄色湿润大菌落； 弧菌：氧化酶（+

13、） ，分科琼脂上淡黄色扁平大菌落； 非发酵菌：氧化酶（+/-） ，分科琼脂上蓝色/无色透明小菌落鲍曼不动杆菌为中等大小， 菌落聚集处产不扩散黄色色素，分离菌落为兰色； 2.5.2.2BA 生长、Choc 生长、MecK 不生长，Gram 染色：G-co氧化酶（+） 、触酶（+） 奈瑟菌：白色/黄色中等大小菌落，该类细菌为口腔常见正常菌群，该菌在痰培养中含量的 高低反应了标本采集状态的合格程度，大量出现提示培养结果将是不可信的； 卡他莫拉菌：白色小菌落（24h 内） ，菌落有脆性，用接种环推之可移，是儿科和老年病人常 见的下呼吸道病原菌； 2.5.2.3BA 不生长/细小、Choc 生长、Mec

14、K 不生长，Gram 染色：G-b、菌体细小或呈扭 曲之长丝状 嗜血杆菌：灰色/无色，半透明，1.5-2.0mm 的多为流感嗜血杆菌17，该菌为最常见的肺部 感染病原菌，可发生于各个年龄层次，其高携带与 COPD 发病有较强的相关性；灰色略黄， 不透明，1.0-1.5mm 的多为副流感嗜血杆菌。一般副流感嗜血杆菌不导致肺部感染，大量出 现提示培养结果将是不可信的； 2.5.2.4BA 不生长、Choc 不生长、MecK 不生长、BCYE- 生长/或在含有 L-半胱氨酸、铁离 子、复合抗生素选择剂的强化血琼脂上生长Gram 染色：G-b、菌体细、长丝状 提示可能为军团菌：该菌在 BCYE- 上

15、4872h 为中等大小扁平菌落，灰白色，较粘着；该 菌具有较强的生物危险性，其中嗜肺军团菌可传染； 2.5.3 真菌及奴卡菌：BA、Choc、分科琼脂、CHROMagar 均生长Gram 染色形态、生长速度 真菌：酵母样真菌，菌落中等大小，生长快，多数可在 CHROMagar 上显色；大多为口腔咽喉 正常菌群，一般不导致肺部感染，但免疫缺陷、糖皮质激素、长期大剂量的抗生素使用可增 加该类微生物机会感染的可能性； 烟曲霉菌，丝状真菌菌落，35培养 2448h 时菌落为白色泛绿，72h 后菌落迅速转为 褐色，中心粉末状背面为黄褐色如烟熏状，该菌为肺部最常见的条件致病菌，感染时患者症 状重，预后非常

16、差； 奴卡菌：小菌落，生长慢，菌落皱褶，呈颗粒状，有时产生褐色、黄色、黑色等色素，该类 细菌可导致肺脓肿，标本脓性，有硫磺颗粒者应高度怀疑该菌； 2.5.4 肺炎支原体：固体培养基上，低倍镜或解剖显微镜下为典型“荷包蛋”样菌落，在 Hayflick 双相培养基的液体中使培养基变黄， 该类微生物是最常见的非典型性肺炎的病原体， 在社区获得性感染中有着很高的比例。 2.6 细菌鉴定细菌鉴定： 在痰标本的直接涂片镜检结果的指导下进行分离鉴定：根据痰液涂片直接镜检结果中被炎性 包裹及脓细胞吞噬的细菌的革兰染色后的形态特征为指引，阅读平皿中菌落形态并作菌落细 菌的革兰染色，选择与镜检结果一致的细菌（该步骤应该在经验丰富的高资历微生物检验老 师的带领下进行） ，必要时进行纯培养，再根据该细菌在各种不同培养基上的生长情况及相 应菌落特征进行初步鉴定和分群，随后在细菌革兰氏染色镜检特点、触酶、氧化酶等简单试 验的进一步鉴定和分群到相关的科或属后采用相应的编码鉴定系统鉴定手工或自动化鉴定， 对溶血性链球菌及肺炎链球菌在生化反应的同时采用乳胶试剂作为补充。为了缩短鉴定时间 还可